凋亡調(diào)控相關(guān)基因FAF1、Bcl-2和Survivin在H pylori感染胃癌變過程中的表達(dá)機(jī)制初探及臨床意義.pdf

1、研究背景及目的：幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hpylori)感染作為一個(gè)明確的致癌因素已得到廣泛公認(rèn)，在Correa提出的由“慢性淺表性胃炎(CSG)-慢性萎縮性胃炎(CAG)-腸上皮化生(IM)-不典型增生(AH)-胃癌(GC)”被公認(rèn)為人類胃癌，尤其是腸型胃癌發(fā)生的典型模式，H pylori被認(rèn)為是這一發(fā)展過程的首要推動(dòng)因子。胃癌是一種基因病，胃癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因改變逐漸累積的結(jié)果，不同的基因可能在不同

2、的階段發(fā)揮作用。在這個(gè)復(fù)雜的多基因作用過程中，不僅與原癌基因的激活和抑癌基因的突變有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡基因密切相關(guān)。在H pylori感染所致癌變過程中，凋亡相關(guān)基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到一個(gè)關(guān)鍵性的作用，但目前H pylori感染在胃癌發(fā)病中的確切作用及細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制及兩者之間的相關(guān)性尚未闡明，特別是在凋亡調(diào)控機(jī)制中，凋亡誘導(dǎo)/抑制基因可能在不同階段發(fā)揮不同作用，而它們與H pylori感染所致胃癌變過程中作用的雙面性及可能機(jī)

3、制更有待探索。Fas相關(guān)因子1(Fas-associated factor1，F(xiàn)AF1)是新近發(fā)現(xiàn)的Fas死亡信號(hào)結(jié)合體的成員之一，其N-末端區(qū)域能與Fas特異性的結(jié)合，它是能夠增強(qiáng)Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白分子，且在胃癌組織中有特異性低表達(dá)，關(guān)于FAF1的作用目前知道的尚少，在我們的前期研究中初步證實(shí)FAF1在胃癌組織中低表達(dá)，作為凋亡誘導(dǎo)因子，與Hpylori感染所致胃癌變的相關(guān)性及作用機(jī)理尚無相關(guān)報(bào)道。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-

4、cell lymphoma/Leukemia-2，Bcl-2)基因是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制基因，是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。業(yè)已證明Bcl-2是最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。生存素(Survivin)是IAP家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，作用于各凋亡途徑的匯集點(diǎn)。Survivin在正常成熟的人體組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在人類大多數(shù)腫瘤組織中均存在陽(yáng)性高表達(dá)，提示它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。關(guān)于H p

5、ylori感染與胃癌變過程中凋亡抑制基因Bcl-2與Survivin的表達(dá)作用機(jī)制目前研究也尚不多，且在這個(gè)過程中與FAF1如何共同發(fā)揮作用也有待探索。因此本研究旨在為闡明胃癌變過程中H pylori感染與這些凋亡調(diào)控相關(guān)基因FAF1、Bcl-2、Survivin的表達(dá)的相關(guān)性及可能作用機(jī)制，并進(jìn)一步結(jié)合臨床相關(guān)資料，探討這些凋亡調(diào)控相關(guān)基因在胃癌的早期診斷、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后判斷中的作用，以便為胃癌的早期診斷和治療提供具有參考價(jià)值的分子

6、生物學(xué)指標(biāo)。
　　方法用快速尿素酶法、W-S銀染法和美藍(lán)法聯(lián)合檢測(cè)62例慢性淺表性胃炎(CSG)、55例慢性萎縮性胃炎(CAG)、52例腸化生(IM)、46例不典型增生(AH)、65例胃癌(GC)組織中H pylori的感染，并采用免疫組化分別檢測(cè)標(biāo)本中凋亡調(diào)控相關(guān)基因FAF1、Bcl-2、Survivin蛋白的表達(dá)，脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢查細(xì)胞凋亡水平，分析H pylori感染在胃癌變過程中與F

7、AF1、Bcl-2、Survivin蛋白的表達(dá)相關(guān)性及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系;進(jìn)一步采用熒光定量法檢測(cè)標(biāo)本中FAF1 mRNA、Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA的表達(dá)水平，探討H pylori感染對(duì)FAF1、Bcl-2、Survivin基因水平調(diào)控的影響;并結(jié)合臨床病例的病理學(xué)特征及隨訪資料，探討凋亡調(diào)控相關(guān)基因FAF1、Bcl-2和Survivin在胃癌的早期診斷、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后判斷中的作用。
　　結(jié)果
　　第

8、一部分:
　　1.GC形成中的H pylori感染率本組280例病例中，三種方法聯(lián)合檢測(cè)H pylori感染率為53.6％，H pylori感染在CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中隨著病變惡性程度的增加而感染率增加，分別為30.6％，49.1％，55.8％，65.2％，69.2％。 H pylori感染率CAG、IM、AH和AC組較CSG組均明顯升高(p＜0.05);GC組H pylori感染率較CAG組升高(p＜0.05

9、)。
　　2.GC形成過程中的FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系在CS G→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1的陽(yáng)性表達(dá)率隨病變程度加重而逐漸降低，分別為72.6％，65.5％，63.8％，54.3％，36.8％，AH組較CSG陽(yáng)性率降低(p＜0.05)，GC組較CSG、CAG、IM組明顯降低(p＜0.01);Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率隨病變程度加重而逐漸升高，分別為16.1％，21.8％，32

10、.7％，50.0％，61.5％，其中IM組較CSG組陽(yáng)性率升高(p＜0.05);AH、GC組較CSG、CAG組陽(yáng)性率明顯升高(p＜0.01);Survivin蛋白在CSG組織中未見表達(dá)，在非癌性病變組織中表達(dá)程度較弱，在胃癌組織中表達(dá)程度較高，分別為0，9.1％，17.3％，45.7％，63.1％，AH、GC組較CSG、CAG、IM組陽(yáng)性率明顯升高(p＜0.01)。
　　細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)在CSG、CAG階段逐漸升高，在AH、G

11、C階段逐漸降低，CAG、IM組較CSG組AI明顯升高(p＜0.01);AH、GC組較CSG、CAG、IM組AI明顯降低(p＜0.01)。
　　在CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1陽(yáng)性表達(dá)者凋亡指數(shù)均高于FAF1陰性，且各組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01);CAG、IM、AH、GC組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)者凋亡指數(shù)均低于Bcl-2陰性，且在IM、AH及GC組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01);C

12、AG、IM、AH、GC組Survivin陽(yáng)性表達(dá)者凋亡指數(shù)均低于Survivin陰性，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　在CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1的表達(dá)與病變惡性程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.251，p＜0.05），Bcl-2、Survivin的表達(dá)與病變惡性程度呈正相關(guān)（r=0.361，0.535，p均＜0.01）。FAF1陽(yáng)性率與Bcl-2和Survivin陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.958、-0.9

13、71，p均＜0.05），Bcl-2陽(yáng)性率與Survivin陽(yáng)性率呈正相關(guān)（r=0.995，p＜0.01）。FAF1的陽(yáng)性率與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)趨勢(shì)（r=0.738，p＞0.05），Bcl-2和Survivin的陽(yáng)性率與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（r=-0.748、-0.782，p均＞0.05）。
　　3.GC形成過程中H pylori感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系在CSG組，H pylori陽(yáng)性AI高于H pylori陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t'=

14、2.055，p＜0.05)，而在GC組，H pylori陽(yáng)性AI低于H pylori陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t'=2.817，p＜0.05)，在其余三組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　4.GC形成過程中H pylori感染對(duì)FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的影響 H pylori陽(yáng)性AH、GC組FAF1陽(yáng)性表達(dá)率低于H pylori陰性組，且在GC組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，CSG、CAG和IM組H

15、 pylori陽(yáng)性者FAF1陽(yáng)性表達(dá)率略高于H pylori陰性組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。H pylori陽(yáng)性CSG、CAG、IM、AH、GC組Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性率均高于H pylori陰性組，且在GC組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。H pylori陽(yáng)性CAG、IM、AH、GC組Survivin表達(dá)陽(yáng)性率均高于H pylori陰性組，且在AH、GC組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　第二部分:
　　1.GC形

16、成過程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA的表達(dá)水平
　　FAF1mRNA在不同胃黏膜病變組織中均能檢測(cè)到表達(dá)，在GC組mRNA相對(duì)表達(dá)量較低。Bcl-2mRNA在CSG→CAG→IM→AH→GC中陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.6％(14/62)，30.9％(17/55)，40.4％(21/52)，58.7％(27/46)，69.2％(45/65)。SurvivinmRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為0，12.7％(7/55),25.0

17、％(13/52),54.3％(25/46),75.4％(49/65)。FAF1mRNA在C SG→CAG→IM→AH→GC表達(dá)水平分別為0.136±0.008，0.131±0.009，0.128±0.010，0.094±0.032，0.006±0.003; Bcl-2mRNA表達(dá)水平分別為0.095±0.015,0.115±0.012,0.173±0.027,0.224±0.042,0.368±0.036; SurvivinmRNA表達(dá)

18、水平分別為0，0.068±0.007，0.347±0.060，0.553±0.080，1.646±0.356。可以看到，隨著惡變程度的進(jìn)展，F(xiàn)AF1 mRNA的表達(dá)量逐漸下降，而Bcl-2和SurvivinmRNA表達(dá)陽(yáng)性率和表達(dá)量逐漸上升。三個(gè)基因在IM階段開始有表達(dá)差異，在GC組差異最為顯著，AH組次之。
　　2.GC形成過程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析經(jīng)Spearman Correlat

19、ions等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，在CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1mRNA的表達(dá)與病變惡性程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827，p＜0.01)，Bcl-2、Survivin mRNA表達(dá)與病變惡性程度呈正相關(guān)（r分別0.945，0.918，p均＜0.01）。經(jīng)Bivariate Correlations分析，CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1 mRNA表達(dá)量與Bcl-2和SurvivinmRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r分

20、別為-0.911、-0.890，p均＜0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)量與SurvivinmRNA表達(dá)量正相關(guān)（r=0.906，p＜0.01）。
　　3.GC形成過程中FAF1、Bcl-2和Survivin三者基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析
　　經(jīng)Bivariate Correlations分析，在CSG→CAG→IM→AH→GC發(fā)展過程中，F(xiàn)AF1基因與蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.298，p＜0.01），Bcl-2基因與

21、蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.324，p＜0.01），Survivin基因與蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.403，p＜0.01），均具有一致性。
　　4.GC形成過程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA的表達(dá)與H pylori感染狀況之間的關(guān)系
　　在CSG和CAG組中，H pylori陽(yáng)性者FAF1mRNA的表達(dá)略高于Hpylori陰性，在IM組始這種趨勢(shì)發(fā)生改變，在AH、GC組H pylori陽(yáng)性FAF1mRNA的

22、表達(dá)均明顯低于H pylori陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01);Bcl-2 mRNA的表達(dá)在IM、AH、GC組H pylori陽(yáng)性均明顯高于H pylori陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01);Survivin mRNA的表達(dá)在AH、GC組H pylori陽(yáng)性均明顯高于H pylori陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。隨著胃黏膜惡變程度的加重，H pylori感染對(duì)FAF1 mRNA的表達(dá)起下調(diào)

23、作用，而對(duì)Bcl-2mRNA和SurvivinmRNA的表達(dá)起上調(diào)作用。
　　第三部分:
　　1.FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)與胃癌各臨床病理特征的相關(guān)性
　　相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)AF1表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、腫瘤的浸潤(rùn)程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期密切相關(guān)(p＜0.01)。Bcl-2表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期密切相關(guān)(p＜0.01)。Sur

24、vivin表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、腫瘤的浸潤(rùn)程度、TNM臨床分期密切相關(guān)(p＜0.05，p＜0.01)。同時(shí)，相關(guān)性分析顯示:胃癌中FAF1表達(dá)與Bcl-2和Survivin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.236，rs=-0.293，p均＜0.01），Bcl-2和Survivin表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.210，p＜0.05）。
　　2.FAF1、Bcl-2和Survivin表達(dá)和臨床病理學(xué)特征的預(yù)后分析
　　經(jīng)單因素分析顯示，F(xiàn)AF1、

25、Bcl-2和Survivin的表達(dá)、腫瘤的大小、發(fā)生部位、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期狀況均是影響生存的預(yù)后因素，其中FAF1的表達(dá)為保護(hù)性因素，其它均為危險(xiǎn)性因素。多因素分析顯示FAF1、Bcl-2和Survivin的表達(dá)均不能成為影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　3.FAF1、Bcl-2和Survivin表達(dá)對(duì)胃癌根治術(shù)患者術(shù)后生存的影響
　　隨著FAF1表達(dá)程度的增加，中位生

26、存時(shí)間延長(zhǎng)，而隨著Bcl-2和Survivin表達(dá)程度的增加，中位生存時(shí)間縮短。FAF1三組比較，1年、3年和5年生存率比較均有顯著性差異(x2=1.029，x2=2.302，x2=6.218，p均＜0.01);Bcl-2四組比較，1年生存率未見差異(x2=2.201，p=0.532)，3年和5年生存率比較均有顯著性差異(x2=13.102，x2=3.017，p均＜0.01);Survivin四組比較，1年、3年和5年生存率比較均有顯著

27、性差異（x2=36.463，x2=43.787，x2=8.646，p均＜0.01）。Log-Rank法生存曲線配對(duì)比較，F(xiàn)AF1三組之間均有顯著差異(p＜0.01，p＜0.05)，Bcl-2組除“-”與“+”外，其余各組之間均有顯著性意義(p＜0.01，p＜0.05)。Survivin組除“-”與“+”、“+”與“++”外，其余各組之間均有顯著性意義(p＜0.01，p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.從蛋白水平和細(xì)胞水平分析

28、FAF1、Bcl-2和Survivin三個(gè)凋亡相關(guān)基因在胃黏膜癌變(CSG→CAG→IM→AH→GC)過程中的變化規(guī)律，顯示了FAF1表達(dá)水平逐漸降低，Bcl-2和Survivin表達(dá)水平逐漸升高，相應(yīng)的由FAF1介導(dǎo)和調(diào)控的胃黏膜細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用逐漸減弱，而Bcl-2和Survivin介導(dǎo)的凋亡抑制作用逐漸增強(qiáng)，尤其發(fā)展到AH階段后凋亡過程受到明顯阻遏，凋亡指數(shù)(AI)明顯降低，凋亡失衡而導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生。
　　2.從基因水平和

29、蛋白水平研究在胃黏膜癌變過程中的H pylori感染對(duì)FAF1、Bcl-2和Survivin的調(diào)控作用，顯示了H pylori感染下調(diào)FAF1 mRNA的表達(dá)，F(xiàn)AF1蛋白表達(dá)水平降低，而上調(diào)Bcl-2和SurvivinmRNA的表達(dá)，Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)水平增高，提示了H pylori感染引起FAF1、Bcl-2和Survivin基因調(diào)控失衡可能是胃癌變的機(jī)制之一。
　　3.臨床分析顯示，F(xiàn)AF1、Bcl-2和S