大腸上皮細胞癌變過程中相關microRNA的靶基因篩選驗證及miR-424的機制研究.pdf

1、前言：
　　大腸癌（Colorectal adenocarcinoma, CRC）是人類消化系統(tǒng)最常見且主要的致死性腫瘤之一。大腸癌是一個多基因、多階段、長期形成的復雜的病變過程。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對提高結(jié)直腸癌的存活率有顯著的意義。因此，探索大腸癌早期病變及其演進過程中的分子機制顯得尤為重要。近來，微小RNA(microRNA，miRNA)由于其在調(diào)控基因表達方面的重要作用，成為關注的焦點。
　　microRNA(mi

2、RNA)是一類長度在18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA分子，通過與靶基因的mRNA3'UTR區(qū)域配對調(diào)控基因的表達進而發(fā)揮生物學功能。研究表明，miRNAs廣泛存表達于各個物種和組織中，并參與調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育、分化、凋亡并影響腫瘤的生長。一些研究證實miRNA具有癌基因或抑癌基因樣作用，可直接參與人類腫瘤（如肺癌、乳腺癌、顱腦腫瘤、肝癌、結(jié)直腸癌及淋巴瘤等）的形成，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中重要分子。研究表明，在大腸癌中差異表達的

3、miRNA均可通過作用于腫瘤相關的靶基因來調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，對于其中絕大部分miRNA，它們作用的靶基因以及具體的生物學功能目前仍有待于進一步研究。
　　本課題組前期研究通過激光捕獲顯微切割技術(Laser capturemicrodissection，LCM)及Agilent芯片技術已經(jīng)對225例大腸腫瘤各個階段病變標本進行全基因組microRNA表達分析，我們發(fā)現(xiàn)有40個miRNA的表達在大腸粘膜上皮轉(zhuǎn)化和演進的過程

4、中存在顯著差異。本研究首先篩選和驗證出在大腸腫瘤轉(zhuǎn)化和演進過程中與miRNA相關的靶基因，同時我們在臨床大腸病變樣本中通過原位雜交方法檢測miR-424的表達，并進一步驗證早期大腸癌中特異性表達的miR-424與目標靶基因的相關關系，探索miR-424的在大腸癌細胞株中的生物學行為，揭示miR-424在大腸癌發(fā)生過程中的生物學功能，為大腸癌的早期發(fā)生提供分子理論依據(jù)，并為其診斷和治療提供新的靶點。
　　第一部分大腸腫瘤轉(zhuǎn)化和演進過

5、程中與microRNA相關靶基因的初步篩選
　　目的:預測并篩選與大腸腫瘤轉(zhuǎn)化和演進相關作用通路中的候選miRNA的目標靶基因。
　　方法:通過miRecords數(shù)據(jù)庫對上述40個miRNA進行靶基因mRNA的預測（整合了至少4個靶基因預測軟件）。結(jié)合上述大腸癌信號通路上的關鍵蛋白，根據(jù)KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫對靶基因mRNA進一步加以篩選。在59例人冰凍大腸組織中（包括18例正常大腸上皮組織，19例大腸腺瘤組織，22例Duk

6、es'A和Dukes'B期大腸腺癌組織），應用熒光實時定量RT-PCR方法檢測上述靶基因mRNA的表達水平及其相應miRNA的表達水平。使用校正t檢驗和差異倍數(shù)超過2倍的篩選條件以miRNA-mRNA表達呈負向關系的規(guī)律，篩選進一步待功能研究的靶基因。
　　結(jié)果:通過miRecords數(shù)據(jù)庫靶點預測以及KEGG數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，其中27個microRNA的靶基因涉及大腸腫瘤轉(zhuǎn)化和演進過程中關鍵的信號通路，相關的靶基因共58個。這些

7、mRNA所翻譯表達的蛋白主要涉及Wnt、TGF-beta、MAPK、p53等重要信號通路。經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，20個mRNA的表達在不同組織中存在顯著差異（t檢驗，p＜0.05），且其表達從正常腸上皮到腺瘤直至Dukes'A/B期腺癌均呈降低趨勢。其中13個mRNA的表達與其相對應的8個miRNA(miR-135b、miR-182、miR-183、miR-34a、miR-424、 miR-552、 miR-769-5p和miR-9

8、6)的芯片表達結(jié)果呈負相關。經(jīng)qRT-PCR進一步驗證發(fā)現(xiàn)，5個miRNA(miR-135b、miR-182、miR-183、miR-424、和miR-96)與9個mRNA(NODAL、SMAD4、MET、CYCS、PDGFRA、MAP2K1、SMAD3、MAP2K4和WNT7A)存在負相關關系。并且miR-424的表達水平在腸腺瘤至Dukes'A/B期腸腺癌存在顯著差異(p＜0.001)，上調(diào)倍數(shù)較其他miRNA高，約為3.12倍。<

9、br>　　結(jié)論:大腸癌信號通路中關鍵蛋白相對應的mRNA表達在不同階段病變的大腸組織中存在顯著差異，其中一些mRNA的表達與其相對應的miRNA表達呈負相關。miRecords和KEGG數(shù)據(jù)庫為microRNA靶基因的預測提供了很好的途徑，在組織水平上可以篩選待進一步功能研究的靶基因。miR-424在腸腺瘤與Dukes'A/B期腸腺癌顯著差異表達引起我們的關注。
　　第二部分原位雜交分析miR-424在早期結(jié)直腸癌及癌前病變中的表

10、達
　　目的:原位雜交實驗檢測miR-424在正常腸上皮、腸腺瘤（低級別上皮內(nèi)瘤變和高級別上皮內(nèi)瘤變）與早期大腸癌的表達水平。
　　方法:在30例石蠟包埋結(jié)直腸切除手術樣本中（包括7例低級別上皮內(nèi)瘤變組織，8例高級別上皮內(nèi)瘤變，15例Dukes'A和Dukes'B期大腸腺癌組織及各自旁的正常組織以供對照研究），使用原位雜交方法檢測miR-424的表達情況。結(jié)合CRi-Nuance多光譜顯微影像系統(tǒng)的光譜檢測技術和inForm

11、軟件，對miR-424在結(jié)直腸病例組織中的表達范圍、漿陽性強度行定量分析。
　　結(jié)果:腸腺瘤和早期大腸癌中miR-424在細胞漿中的平均表達面積比正常腸組織大。Dukes'A/B期大腸癌與癌旁正常組織之間(△=1.16)、高級別上皮內(nèi)瘤變與旁正常組織之間(△=1.56)、低級別上皮內(nèi)瘤變與旁正常組織之間(△=1.56)以及癌旁正常組織與高級別上皮內(nèi)瘤變旁正常組織之間(△=1.32)等組合中miR-424于細胞漿中的表達范圍明顯擴大

12、(p＜0.05); Dukes'A/B期大腸癌比癌旁正常組織(△=1.63)及低級別上皮內(nèi)瘤變(△=1.34);高級別上皮內(nèi)瘤變比低級別上皮內(nèi)瘤變(△=1.29)中miR-424在細胞漿陽性表達的強度比例升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:利用多光譜成像系統(tǒng)能有效的定量檢測miR-424的雜交信號，并證實miR-424在早期腸腺癌及癌旁組織、早期腸腺癌與低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，以及在高級別上皮內(nèi)瘤變

13、與早期大腸癌的腫瘤旁正常組織間顯示出一定的表達差異，但miR-424在早期腸腺癌與高級別上皮內(nèi)瘤變之間的表達未見顯著差異。
　　第三部分:鑒定miR-424候選靶基因及具體生物學功能
　　目的:細胞水平驗證miR-424與其候選靶基因的相互關系，并探討miR-424在結(jié)腸癌DLD1細胞中生物學功能。
　　方法:構建穩(wěn)定高表達miR-424的人結(jié)腸癌DLD1細胞株。運用qRT-PCR、熒光素報告基因檢測系統(tǒng)和Wester

14、n-blot方法檢測miR-424直接調(diào)控的靶基因。采用CCK8實驗、Transwell侵襲及遷移實驗檢測miR-424對人結(jié)腸癌DLD1細胞的生長、侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果:熒光素報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，miR-424能抑制MAP2K1、SMAD3和WNT7A熒光素酶活性。Real-time RT-PCR和Western-blot方法檢測結(jié)果顯示，miR-424能夠抑制SMAD3和WNT7A的蛋白表達，但是mRNA水平無明顯差

15、異。通過Transwell小室侵襲和遷移實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達miR-424的DLD1細胞侵襲和遷移能了均較對照組強，上調(diào)miR-424能夠促進大腸癌細胞株的侵襲及遷移能力。CCK8實驗結(jié)果顯示上調(diào)DLD1細胞中miR-424的表達，對其增殖能力無顯著影響。
　　結(jié)論:miR-424能直接結(jié)合并作用于SMAD33'UTR和WNT7A3'UTR，并且參與SMAD3和WNT7A的蛋白表達的調(diào)節(jié)。 miR-424可促進結(jié)腸癌細胞DLD1侵