NS5A基因在HCV復(fù)制和感染中的作用及16S rDNA用于血液微生物快速篩查研究.pdf

1、本研究對(duì)JFH1 NS5A蛋白在病毒復(fù)制和感染中的作用進(jìn)行了研究。首先建立J6JFH1 (HCV 2a J6的core-NS2與JFH1 NS2-3'UTR組成的2a/2a嵌合體)的體外細(xì)胞模型,并在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)NS5A蛋白；通過(guò)基因置換的方法構(gòu)建全長(zhǎng)基因型間的嵌合基因組,通過(guò)比較嵌合體與野生型基因組的復(fù)制效率和產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(cell culture produced HCV,HCVcc)的能力,探討了NS5A在JF

2、H1株體外高效復(fù)制和感染中發(fā)揮的作用。此外,本研究還對(duì)多種微生物16S rDNAs的序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)、合成了微生物通用及特異性引物,初步建立了基于16S rDNAs的快速篩檢血液及血液制品中微生物污染的熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法。 一、HCV 2a FL-J6JFH細(xì)胞感染模型的建立 全長(zhǎng)HCV 2a型基因組FL-J6JFH和復(fù)制缺陷型陰性

3、對(duì)照FL-J6JFH(GND)線性化后體外轉(zhuǎn)錄成RNA,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞。抽提細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板,以HCV特異的熒光定量PCR(FQ RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平。轉(zhuǎn)染后第5天,FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA為1.2×106GE/μg RNA,在第9天,下降到最低水平6.9×105GE/μg RNA：在13天,上升到最高值6.5×106GE/μg RNA。此后直至第59天

4、,細(xì)胞內(nèi)RNA水平保持在106 GE/μg RNA。與之相對(duì),陰性對(duì)照FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后HCVRNA很快消失。以丙型肝炎患者血清為抗體,免疫熒光染色觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示第5天至第59天,FL-J6JFH轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到HCV蛋白表達(dá),而FL-J6JFH(GND)轉(zhuǎn)染和FL-J6JFH轉(zhuǎn)染以正常人血清檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)都未觀察到HCV蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染的FL-J6JFH可以在Huh-7.5

5、細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間有效復(fù)制。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清感染naive Huh-7.5細(xì)胞,3天后免疫熒光法檢測(cè)HCV蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。從第5天開(kāi)始收集的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清,感染細(xì)胞后都可見(jiàn)HCV蛋白表達(dá)。由此可見(jiàn),全長(zhǎng)2a型基因組FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,能夠產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒(HCVcc)。該細(xì)胞感染模型的建立為研究HCV各基因結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制和HCVcc包裝成熟中的作用提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 二、JFH1 NS5A蛋白的

6、表達(dá)與鑒定 PCR特異擴(kuò)增JFH1 NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1載體,構(gòu)建JFH1 NS5A的原核和真核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-JFH1 NS5A和pEGFP-JFH1 NS5A。將pET-JFH1 NS5A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1 NS5A轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,在原核與真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),以SDS-PAGE、熒光顯微術(shù)和Western blotting方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

7、SDS-PAGE電泳檢測(cè)到融合蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá),熒光顯微鏡觀察、Western blotting檢測(cè)證實(shí)了EGFP-JFH1 NS5A融合蛋白在HEK 293T細(xì)胞中表達(dá)。利用PubMed BLAST軟件對(duì)JFH1與HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白間的同源性進(jìn)行分析。BLAST分析顯示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分別為57％、60％、68％和74％。JFH1 NS5A

8、蛋白在原核與真核細(xì)胞中表達(dá)成功,為研究HCV NS5A在JFH1株復(fù)制中的作用、NS5A與病毒其它蛋白以及宿主蛋白間的相互作用提供了材料。 三、JFH1 NS5A基因置換對(duì)FL-J6JFH病毒復(fù)制和感染性的影響 采用重疊延伸PCR方法聯(lián)合酶切反應(yīng),用我國(guó)HCV感染最常見(jiàn)的基因型(1b型HC-J4株)的NS5A替換了FL-J6JFH的相應(yīng)基因,構(gòu)建基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A。將其和野生型FL-J6JFH體

9、外轉(zhuǎn)錄后分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞。FQ RT-PCR比較二者轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中HCV RNA水平差異。結(jié)果顯示,嵌合體的復(fù)制動(dòng)力學(xué)較野生型明顯減緩。在第9天后的任一時(shí)間點(diǎn),嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平都顯著低于野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞(p<0.05)。在第34天,嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平最高,達(dá)5.6±1.8×104 GE/μg RNA,比野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最高值低126倍(第13天,p<0.05)。用免疫熒光染色和Wester

10、n blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白表達(dá)情況：在第9天后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn),嵌合體和野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下都觀察到了HCV蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。在第9天,裂解野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞Western blotting檢測(cè)到了NS5A蛋白,而嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞未檢測(cè)到。在第13天和59天,嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)也可以檢測(cè)到NS5A蛋白,但表達(dá)量明顯少于野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞。收集細(xì)胞上清,梯度稀釋后感染naive Huh-7.5細(xì)胞,測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的感

11、染滴度。發(fā)現(xiàn)嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清HCVcc滴度顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)的野生型細(xì)胞上清(p<0.05),上清感染性滴度最高為78.3±23.6 ffu/ml,低于野生型上清最高值300倍(p<0.05)。此外,還觀察到了嵌合體和野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所致細(xì)胞病變效應(yīng),自第13天開(kāi)始,野生型FL-J6JFH轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物中持續(xù)出現(xiàn)大量不貼壁的細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢并大量死亡。13天以后,野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)病毒RNA和釋放到上清中的HCVcc量

12、均達(dá)到最大值并維持較高水平。與之相對(duì),嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞一直未觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)。 四、JFH1 NS5A基因?qū)C-J4株病毒復(fù)制和感染性的影響 將JFH1 NS5A置換至HC-J4基因組內(nèi),構(gòu)建嵌合全長(zhǎng)基因組HC-J4/JFHNS5A。將嵌合體和野生型HC-J4的RNA轉(zhuǎn)錄體分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞,用免疫熒光染色和HCV負(fù)鏈RNA特異性RT-PCR法檢測(cè)二者在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)和基因復(fù)制情況。免疫熒光染色未觀察到H

13、CV蛋白在轉(zhuǎn)染了嵌合體和野生型HC-J4細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),但在轉(zhuǎn)染18天以?xún)?nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)都檢測(cè)到了HCV負(fù)鏈RNA。表明嵌合體和野生型HC-J4在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)呈低水平復(fù)制。FQ RT-PCR比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV RNA水平。轉(zhuǎn)染后第9天和第12天,嵌合體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV RNA水平高于野生型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(p<0.05)。但與陽(yáng)性對(duì)照FL-J6JFH相比,一段時(shí)間后轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的HCV即被宿主細(xì)胞清除。 五、基于16S rDNA

14、s的血液微生物污染快速檢測(cè)研究 對(duì)20余種常見(jiàn)致病細(xì)菌的16S rDNAs進(jìn)行多序列比對(duì),設(shè)計(jì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNAs的FQ-PCR通用引物。以12種常見(jiàn)致病細(xì)菌、2種真菌、1種支原體、1種病毒和人基因組DNA為模板,驗(yàn)證通用引物檢測(cè)細(xì)菌的特異性。以通用引物擴(kuò)增金黃色葡萄球菌16S rDNA靶片段,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌作為革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌代表菌,以

15、其不同濃度的DNA為模板進(jìn)行FQ-PCR反應(yīng),檢驗(yàn)該方法的敏感性。抽提梯度稀釋的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌模擬血液細(xì)菌污染標(biāo)本的總DNA作為FQ-PCR反應(yīng)模板,檢驗(yàn)基于16S rDNAs的FQ-PCR作為血液細(xì)菌污染檢測(cè)方法的敏感性。 小結(jié)： 1.建立了HCV 2a型FL-J6JFH的Huh-7.5細(xì)胞感染模型,能夠高效自主復(fù)制并產(chǎn)生感染性病毒顆粒(HCVcc),為進(jìn)行HCV各基因結(jié)構(gòu)功能的研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

16、 2.用HCV 1b型HC-J4株的NS5A置換FL-J6JFH的相應(yīng)基因,構(gòu)建了基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A。與野生型相比,嵌合體在體外復(fù)制效率明顯降低,HCVcc產(chǎn)量顯著減少。將JFH1 NS5A置換至HC-J4基因組內(nèi),在一定程度上提高了HC-J4 RNA的體外復(fù)制水平。表明NS5A在JFH1株高效復(fù)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 3.基因型間嵌合體FL-J6JFH/J4NS5A產(chǎn)生的病毒產(chǎn)物和感染性顆粒遠(yuǎn)低于野生型