致死型約氏瘧原蟲MAP2截短蛋白免疫活性研究.pdf

1、瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播引起的一種感染性寄生原蟲疾病。在國內(nèi)外,瘧疾依然是高發(fā)的感染性寄生蟲病。由于瘧原蟲對抗瘧疾藥品耐藥性和蚊蟲對殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生及擴散,人類與瘧疾之間的斗爭日趨激烈,研制安全有效的瘧疾疫苗成為控制瘧疾的重要途徑和迫切需要。
　　 根據(jù)瘧原蟲的生活史,瘧疾疫苗可分三大類:紅外期疫苗、紅內(nèi)期疫苗和傳播阻斷疫苗。雖然部分紅內(nèi)期、紅外期疫苗已經(jīng)進入臨床試驗,但目前為止,還沒有疫苗上市,在此情況下,針對瘧原蟲有性生

2、殖階段的傳播阻斷疫苗(TBVs,transmission-blocking vaccines)逐漸受到重視,成為瘧疾疫苗研究的熱點。TBVs通過切斷瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育的必要環(huán)節(jié),阻止瘧原蟲向未感染人群的傳播。雖然瘧疾傳播阻斷疫苗的研究取得了一定成果,但總體上,這些研究大多停留在實驗室階段,很少進入臨床試驗期,篩選新的、具有良好免疫原性的傳播阻斷疫苗候選抗原具有重要意義。
　　 瘧原蟲受精或其他有性生殖階段重要蛋白成分是傳播阻斷疫

3、苗研究的靶目標。Pfmap-2(Mitogen-activated ProtonKinasc 2)是公認的惡性瘧原蟲MAPK同源基因,其特異地在配子體階段表達;研究顯示,敲除惡性瘧原蟲MAP2基因,雄配子形成完全受阻,這些特點提示MAP2蛋白可能具有成為傳播阻斷疫苗候選抗原的潛力。
　　 根據(jù)以上研究,本實驗以致死型約氏瘧原蟲MAP2蛋白作為研究對象,應用生物信息學方法對抗原的各種參數(shù)進行分析,從中篩選出所需基因片段,有目的地進

4、行擴增,構(gòu)建相應真核表達載體,進行動物免疫,觀察其免疫活性,以期篩選出優(yōu)勢靶抗原,為瘧疾傳播阻斷疫苗的研發(fā)提供理論基礎和實驗室依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、約氏瘧原蟲MAP2基因片段的獲取
　　 1、約氏瘧原蟲MAP2基因序列分析
　　 應用生物信息學手段,對致死型約氏瘧原蟲MAP2基因編碼產(chǎn)物的抗原決定簇、跨膜區(qū)域等進行預測分析。
　　 2、約氏瘧原蟲基因組DNA的提取
　　 用免疫教

5、研室饋贈的致死型約氏瘧原蟲感染野生昆明鼠,感染第三天小鼠眼球取血,按照天根生化科技有限公司的血液基因組提取試劑盒說明書,提取瘧原蟲基因組DNA。
　　 3、PCR方法從提取的基因組中擴增MAP2基因片段
　　 4、凝膠純化PCR產(chǎn)物
　　 將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,切下瓊脂糖凝膠電泳后含目的片段的膠塊,按照天根生化科技有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物的回收。
　　 5、原核載體的構(gòu)建及

6、陽性克隆的鑒定
　　 將所得的目的片段及pGEX6p-1載體用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后分別回收所需目的片段及開環(huán)的pGEX6p-1載體,將兩者連接,命名為pGEX6p-1/MAP2。挑取平板上生長的可疑陽性菌落進行增菌,質(zhì)粒提取后用XhoⅠ或ScaⅠ單酶切鑒定。
　　 二、構(gòu)建pcDNA3.1(+)/MAP2表達載體
　　 1、目的基因的獲取
　　 擴增含有pGEX6p

7、-1/MAP2質(zhì)粒的大腸桿菌,提取質(zhì)粒做為模板,設計引物(引物含起始密碼子、終止密碼子、酶切位點),PCR擴增MAP2基因。
　　 2、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段(同上)
　　 3、真核表達載體的構(gòu)建及陽性克隆的鑒定
　　 將所得的目的片段及pcDNA3.1(+)載體用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后分別回收所需目的片段及開環(huán)的pcDNA3.1(+)載體,將兩者連接,命名為

8、pcDNA3.1(+)/MAP2。挑取平板上生長的可疑陽性菌落進行增菌,提取質(zhì)粒后用HindⅢ和PstⅠ雙酶切鑒定并測序。
　　 4、重組質(zhì)粒的大量制備
　　 待得到正確的測序結(jié)果后,按照天根生化科技有限公司質(zhì)粒大量提取試劑盒的說明,大量提取質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,供轉(zhuǎn)染和免疫使用。
　　 三、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核細胞COS7中瞬時表達
　　 將

9、構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2轉(zhuǎn)染處于指數(shù)生長期的COS7細胞,培養(yǎng)48小時后用間接免疫熒光的方法檢測其在細胞中的表達情況。
　　 四、質(zhì)粒在動物體內(nèi)免疫活性的檢測
　　 1、動物的免疫
　　 取4～6周齡BALB/c小鼠51只,隨機分為3組,前兩組分別在小鼠后肢股四頭肌注射質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,注射體積100μl,濃度1μg/lμl;第3組注射相同體積生理鹽水

10、。實驗動物每隔三周加強免疫一次,共免疫3次。
　　 2、免疫小鼠血清的收集及血清中抗體IgG的檢測
　　 在每次免疫兩周后,小鼠眼球取血,提取并保存血清。用ELISA方法檢測血清中IgG抗體及其亞類的濃度。
　　 3、免疫小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液的制備及細胞因子的檢測
　　 在每次免疫兩周后,小鼠取脾,進行脾細胞培養(yǎng),48小時后,用ELISA方法檢測脾細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10

11、的濃度。
　　 4、統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)值以均數(shù)士標準差(-X±SD)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,組間比較采用單因素方差分析,0.01＜P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義,P＜0.01表示有顯著性差異。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、約氏瘧原蟲MAP2基因片段的獲取
　　 1、生物信息學分析
　　 采用http://www.cbs.dtu.dk/services/

12、TMHMM/及http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic-pl在線預測網(wǎng)站對致死型約氏瘧原蟲MAP2基因編碼蛋白的跨膜區(qū)域、抗原決定簇等進行預測,分析顯示:390bp～1542bp處的核酸序列為胞外蛋白編碼區(qū)并且該區(qū)產(chǎn)物優(yōu)勢抗原決定簇較集中。
　　 2、PCR方法擴增MAP2基因片段
　　 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,獲得大小約為1000bp的產(chǎn)物條帶,與預期結(jié)果(1152bp)一致。

13、
　　 3、原核表達質(zhì)粒pGEX6p-1/MAP2的鑒定
　　 質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ或ScaⅠ單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,前者獲得大小約為4800bp的一條帶,后者獲得兩條大小約為1700bp和3100bp的條帶,與預期結(jié)果一致。
　　 二、真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2的鑒定
　　 (1)質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和PstⅠ雙單酶切后瓊脂糖凝膠電泳,獲得三條帶,大小分別約為1000bp、1500bp和4000

14、bp,與預期結(jié)果(993bp、1643bp及4003bp)一致。
　　 (2)TaKaRa公司的測序結(jié)果表明,構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2包含所選取基因片段的正確序列、起始密碼子ATG、終止密碼子TAA及BamHⅠ/XhoⅠ酶切位點。
　　 三、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核細胞COS7中的瞬時表達
　　 間接免疫熒光顯示,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/MAP2后的細胞漿中出現(xiàn)黃綠色熒

15、光,核著藍色,而對照組即空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組僅核著藍色,胞漿并無綠色熒光。說明構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/MAP2能在真核細胞中正常表達。
　　 四、質(zhì)粒在動物體內(nèi)免疫活性的檢測
　　 1、免疫小鼠血清IgG抗體及其亞類的檢測
　　 小鼠初次免疫后14天,實驗組即pcDNA3.1(+)/MAP2組小鼠血清總IgG抗體水平已明顯高于空白對照組(生理鹽水組)及陰性對照組(pcDNA3.1(+)組)(P＜0

16、.01),實驗組IgG1、IgG2a和IgG2b水平均明顯高于空白對照組(P＜0.01),IgG1水平高于IgG2a(P＜0.5);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),總IgG抗體水平持續(xù)升高,但檢測的IgG抗體亞類升高緩慢;整個過程中,空白對照組和陰性對照組之間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 2、免疫小鼠脾細胞培養(yǎng)上清液細胞因子的檢測
　　 小鼠初次免疫后14天,實驗組小鼠細胞

17、因子IL-4、IL-10水平高于空白對照組及陰性對照組(P＜0.05),且IL-10水平顯著升高(P＜0.01);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),IL-4、IL-10維持在較高水平,但升高緩慢;整個過程中,空白對照組和陰性對照組之間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05),IFN-γ、IL-2水平無統(tǒng)計學變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了致死型約氏瘧原蟲MAP2截短蛋白