DNA-PKcs對c-myc蛋白穩(wěn)定性調(diào)控作用的研究.pdf

1、DNA-PKcs是DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位(DNADependentProteinKinaseCatalyticSubunit)，與另外兩個亞單位Ku70和Ku80共同構(gòu)成DNA-PK復(fù)合物。與ATM、ATR等同屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3kinase-relatedproteinkinase，PIKK)超家族成員。最初確定的DNA-PKcs的功能是參與DNA雙鏈斷裂的非同源末端

2、連接(NHEJ)和V(D)J重組，后來又發(fā)現(xiàn)其在維持染色體端粒末端結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮重要的作用。研究顯示DNA-PKcs以其絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶活性可磷酸化多種重要的功能蛋白底物，包括有多種癌基因產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄因子，如c-fos、c-myc、oct-1、c-jun等，表明DNA-PKcs是一種具有多種功能的蛋白。 近年來有越來越多的實驗研究報道，DNA-PKcs在腫瘤組織中異常高表達(dá)。如Hosoi等發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤組織中DNA-P

3、Kcs的mRNA和蛋白水平以及激酶活性均高于正常組織，Um等發(fā)現(xiàn)在侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的腫瘤組織中DNA-PKcs的蛋白表達(dá)和激酶活性高于侵襲轉(zhuǎn)移能力低的腫瘤細(xì)胞，由此推測DNA-PKcs與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。此外，某些組織來源細(xì)胞的不同發(fā)育階段DNA-PKcs的表達(dá)水平也不同，生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前DNA-PKcs表達(dá)明顯高于減數(shù)分裂后，而一些沒有增殖能力的細(xì)胞根本不表達(dá)DNA-PKcs或DNA-PKcs表達(dá)水平非常微弱。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，在

4、輻射誘發(fā)的部分癌變細(xì)胞中DNA-PKcs表達(dá)和激酶活性均顯著提高；通過免疫組化分析顯示約90％的肝癌患者的癌組織中DNA-PKcs表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而對照的正常肝組織中所檢測到的DNA-PKcs水平明顯要低；發(fā)現(xiàn)肺癌組織中DNA-PKcs的蛋白水平和激酶活性也明顯高于癌旁組織。本論文在前期研究結(jié)果的啟示下，對DNA-PKcs的功能以及作為抗癌靶分子的可行性進(jìn)行深入研究，取得了如下主要進(jìn)展： (1)利用DNA-PKcs抑制劑三氟拉嗪(

5、TFP)和γ射線分別處理HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示TFP對HeLa細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，隨著藥物劑量的增大和用藥時間的延長，細(xì)胞生長速度減慢，凋亡率增加，而且TFP可增加細(xì)胞對輻射的敏感性。進(jìn)一步分析其分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，TFP或γ射線作用HeLa細(xì)胞后，都可誘導(dǎo)DNA-PKcs的降解，而且TFP可增加射線導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs的切割降解程度，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞對輻射的敏感性。另外，MAPK激酶p38激活被

6、認(rèn)為在HeLa細(xì)胞中起對抗凋亡的作用，抑制p38活化可有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，實驗結(jié)果表明TFP可抑制γ射線誘導(dǎo)的p38磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 (2)為了進(jìn)一步研究DNA-PKcs在腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化中的作用，我們利用更為特異的RNA干擾技術(shù)(siRNA)成功的使DNA-PKcs蛋白表達(dá)下降，獲得了DNA-PKcs表達(dá)沉默的穩(wěn)定細(xì)胞模型。結(jié)果表明細(xì)胞對γ射線及紫外線的敏感性增加，DNA-PKcs表達(dá)沉默細(xì)胞的生長速度和接種裸

7、鼠后形成腫瘤的生長速度減慢。這些結(jié)果表明DNA-PKcs除通過其DNA修復(fù)功能影響細(xì)胞的輻射敏感性外，還可能與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。 (3)利用基因芯片技術(shù)對DNA-PKcs表達(dá)沉默細(xì)胞以及對照細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平比較，發(fā)現(xiàn)15個與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因在DNA-PKcs表達(dá)沉默細(xì)胞中表達(dá)升高，其中一半是與干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)有關(guān)的基因。8個基因表達(dá)下降，包括有細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。RT-PCR半定

8、量分析結(jié)果與芯片結(jié)果相一致。又利用SEAP報告質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行檢測，進(jìn)一步證實其中的NFAT轉(zhuǎn)錄活性下降。以上結(jié)果提示DNA-PKcs具有直接或間接調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，而且大多與細(xì)胞增殖分化有關(guān)。值得注意的是，其中部分是c-myc的靶基因如P21、P27、NDRG-1。 (4)鑒于DNA-PKcs影響表達(dá)的部分基因是c-myc蛋白的靶基因，利用DNA-PKcs沉默表達(dá)細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討了DNA-PKcs新的生化功能。利

9、用Westernblot檢測原癌基因c-myc的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)抑制后，c-myc蛋白表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞中c-myc蛋白對靶基因轉(zhuǎn)錄的激活作用也隨之降低。DNA-PKcs抑制劑Wortmannin同樣可抑制c-myc的蛋白表達(dá)和活性。但是在上述條件下c-myc的mRNA表達(dá)水平幾乎無任何變化，表明DNA-PKcs是在蛋白水平調(diào)節(jié)c-myc表達(dá)。進(jìn)一步的免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，DNA-PKcs與c-myc蛋白存在

10、相互結(jié)合作用。以上表明DNA-PKcs具有維持c-myc蛋白穩(wěn)定性的功能，DNA-PKcs有可能通過此信號通路在一定程度上參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。 (5)DNA-PKcs如何調(diào)控c-myc蛋白穩(wěn)定性是本研究進(jìn)一步關(guān)注的焦點，根據(jù)最新的文獻(xiàn)資料和本研究的實驗結(jié)果，我們提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信號通路，為此又做了進(jìn)一步分析驗證。用泛素化蛋白酶體的抑制劑(MGl32)及GSK3抑制劑氯化鋰(LiCl)分別處理

11、細(xì)胞，結(jié)果表明MGl32和LiCl處理后能逆轉(zhuǎn)DNA-PKcs表達(dá)沉默后細(xì)胞中c-myc蛋白水平的下降，這樣為確認(rèn)DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc信號通路提供了關(guān)鍵性實驗依據(jù)。 (6)本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs可與CyclinT2相互結(jié)合，而CyclinT2參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，因此我們推測也許DNA-PKcs在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(TCR)中起著一定的作用。為了驗證DNA-PKcs的TCR功能，首先建立了一種

12、基于DNA鏈特異性PCR方法檢測DNA轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)的新技術(shù)，利用此技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，對照細(xì)胞NC中DHFR基因轉(zhuǎn)錄鏈的修復(fù)要明顯快于非轉(zhuǎn)錄鏈以及DNA-PKcs表達(dá)沉默細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄鏈，而兩組細(xì)胞的泛基因組修復(fù)水平無明顯差異，首次表明DNA-PKcs參與DNA轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)反應(yīng)。 本課題研究首次發(fā)現(xiàn)了DNA-PKcs對c-myc蛋白穩(wěn)定性的影響，并提出了DNA-PKcs/Akt/GSK3/c-myc的信號調(diào)節(jié)通路，為闡述DNA-PKc