土壤活性顆粒與DNA的相互作用及其對(duì)DNA穩(wěn)定性、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增的影響.pdf

1、采集我國(guó)地帶性土壤山東泰山天外村棕壤，分離提取粗膠體(0.2-2μm)和細(xì)膠體(<0.2 um)，對(duì)兩部分膠體進(jìn)行去有機(jī)質(zhì)和不去有機(jī)質(zhì)處理，得到0.2-2μm含有機(jī)質(zhì)粘粒、0.2-2μm去有機(jī)質(zhì)粘粒、小于0.2 μm含有機(jī)質(zhì)粘粒和小于0.2μm去有機(jī)質(zhì)粘粒。以上述不同類型的棕壤膠體、蒙脫石、羥基鋁-蒙脫石復(fù)合物，高嶺石和針鐵礦為實(shí)驗(yàn)材料，研究了DNA在土壤膠體和礦物表面的吸附解吸行為和結(jié)合機(jī)制、固定態(tài)DNA的穩(wěn)定性和細(xì)胞轉(zhuǎn)化、固定態(tài)質(zhì)粒

2、DNA的PCR擴(kuò)增以及土壤膠體和礦物對(duì)微生物代謝活性的影響，獲得如下主要結(jié)果： 1.運(yùn)用吸附和解吸等化學(xué)方法和現(xiàn)代儀器分析手段如衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(ATR/FTIR)、圓二色光譜(CD)、熒光光譜、微量熱分析技術(shù)，系統(tǒng)探討了恒電荷土壤活性顆粒表面。DNA吸附、解吸及固定的特點(diǎn)，基本揭示了DNA分子在不同類型土壤活性顆粒表面的結(jié)合機(jī)制。DNA在土壤膠體和礦物表面的最大吸附量順序?yàn)椋好擅撌?>去有機(jī)質(zhì)細(xì)粘粒>含有機(jī)質(zhì)細(xì)粘粒

3、>高嶺石>去有機(jī)質(zhì)粗粘粒>含有機(jī)質(zhì)粗粘粒。上述結(jié)果表明，DNA可能主要通過(guò)脫水作用和靜電力作用吸附在含有機(jī)質(zhì)粘粒和蒙脫石表面，而在去有機(jī)質(zhì)粘粒和高嶺石表面，氫鍵和配位交換可能是DNA吸附的主要作用力。ATR/FTIR結(jié)果顯示固定在去有機(jī)質(zhì)粘粒和高嶺石表面的DNA構(gòu)型由原來(lái)的B型變?yōu)閦型；而蒙脫石和含有機(jī)質(zhì)粘粒表面。DNA的構(gòu)型仍為B型。通過(guò)熒光光譜和CD譜觀察到從高嶺石表面解吸的DNA為C型，而蒙脫石和土壤膠體表面解吸的DNA仍為B型。

4、 2.查明了不同類型的有機(jī)和無(wú)機(jī)配體對(duì)土壤活性顆粒表面DNA吸附的影響。體系中檸檬酸、酒石酸和磷酸濃度從0 mM增加到5 mM，DNA在蒙脫石和高嶺石表面的吸附量顯著降低；隨著配體濃度繼續(xù)增加，DNA在蒙脫石和高嶺石表面的吸附量逐漸增加。在土壤膠體體系中，隨著配體濃度的增加，DNA的吸附量降低，各配體抑制效率的大小順序?yàn)椋毫姿?檸檬酸>酒石酸。和去有機(jī)質(zhì)粘粒相比，配土壤活性顆粒與DNA的相互作用及其對(duì)DNA穩(wěn)定性、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和PC

5、R擴(kuò)增的影響體對(duì)含有機(jī)質(zhì)粘粒表面DNA吸附的抑制效果更強(qiáng)。這些結(jié)果表明，配體對(duì)DNA吸附的影響和配體的類型、濃度以及土壤組分的表面性質(zhì)密切相關(guān)。在配體加入體系之前先加入DNA的處理使DNA在土壤膠體表面的吸附量最大。對(duì)于蒙脫石和高嶺石而言，在DNA加入之前先加入配體的處理使DNA吸附量最大。 3.選取土壤中兩種常見(jiàn)的細(xì)菌如革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽胞桿菌和革蘭氏陰性菌惡臭假單胞菌，率先研究了細(xì)菌對(duì)土壤膠體和礦物體系吸附DNA的影響。發(fā)

6、現(xiàn)兩種細(xì)菌細(xì)胞對(duì)DNA的吸附量沒(méi)有顯著差異，DNA主要通過(guò)范德華力和靜電力作用吸附在細(xì)菌表面，惡臭假單胞菌表面的DNA更易被解吸。除了惡臭假單胞菌對(duì)高嶺石體系中DNA的吸附影響較小之外，在土壤膠體或礦物體系中加入蘇云金芽孢桿菌和惡臭假單胞菌均可顯著促進(jìn)DNA的吸附。與惡臭假單胞菌相比，蘇云金芽孢桿菌更能促進(jìn)DNA在土壤膠體表面的吸附。 4.合成了含有不同濃度羥基鋁的蒙脫石復(fù)合物(2.5，10.0和20.0 mmol Al/g蒙脫

7、石，用AM<,2.5>，AM<,10>和AM<,20>表示)，探討了DNA在其表面的吸附解吸行為和結(jié)合機(jī)制。發(fā)現(xiàn)羥基鋁在蒙脫石表面的包被顯著降低了蒙脫石對(duì)DNA的吸附量，但增強(qiáng)了對(duì)DNA的結(jié)合強(qiáng)度，使吸附態(tài)DNA分子很難被解吸。在Na<,2>HPO<,4>-NaH<,2>PO<,4>體系中，DNA在蒙脫石或羥基鋁蒙脫石復(fù)合物表面的吸附量顯著高于其在Tris-HCl體系中的吸附量，但DNA的吸附親和力較低；隨著蒙脫石表面羥基鋁含量的增加，

8、DNA的吸附量顯著降低，這表明在羥基鋁.蒙脫石復(fù)合物表面，磷酸根陰離子與DNA分子形成了強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)作用。體系中CaCl<,2>濃度的增加或pH的降低均可促進(jìn)DNA在羥基鋁一蒙脫石復(fù)合物表面的吸附。蒙脫石，AM<,2.5>，AM<,10>和AM<,20>表面的吸附態(tài)DNA用Tris-HCl充分洗滌，解吸率分別為65.01，30.00，8.04和5.18％，這表明蒙脫石表面羥基鋁的存在可顯著增強(qiáng)DNA的吸附強(qiáng)度。應(yīng)用等溫滴定微量熱技術(shù)測(cè)定了

9、DNA在蒙脫石和羥基鋁-蒙脫石復(fù)合物表面吸附的焓變，結(jié)果顯示DNA在蒙脫石表面的吸附為吸熱反應(yīng)(△H<,ads>=1.15 J/g)，而在羥基鋁.蒙脫石復(fù)合物表面的吸附為放熱反應(yīng)(-9.50<△H<,ads><-6.64 J/g)。DNA分子的堿基和磷酸基團(tuán)參與了吸附過(guò)程，固定在AM<,10>和AM<,20>表面的DNA構(gòu)型由原來(lái)的B型變?yōu)閆型，且和DNA分子之間形成了氫鍵。上述結(jié)果表明，DNA可能主要通過(guò)靜電引力、氫鍵和配位交換等多種

10、作用力吸附在羥基鋁.蒙脫石復(fù)合物表面。掃描電鏡結(jié)果顯示，DNA可在AM<,10>表面形成了一層薄膜，而在蒙脫石表面沒(méi)有觀察到。 5.首次聯(lián)合應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)和等溫滴定微量熱技術(shù)，揭示了土壤膠體和礦物體系(表面)固定態(tài)染色體DNA的穩(wěn)定性特點(diǎn)，基本闡明了固定態(tài)：DNA抗核酸酶降解的機(jī)制。凝膠電泳結(jié)果顯示，核酸酶濃度為2μg.ml<'-1>時(shí)，DNA的條帶消失，DNA完全被降解。體系中核酸酶濃度為20μg/mL時(shí)，高嶺石、去有機(jī)質(zhì)粗

11、粘粒和細(xì)粘粒體系中的DNA在23 kb處的條帶全部消失，僅剩一些大約2 kb和4 kb的碎片斷。對(duì)于蒙脫石、含有機(jī)質(zhì)粗粘粒和細(xì)粘粒體系中的：DNA而言，即使核酸酶濃度增加到40 μg/mL，DNA的條帶均無(wú)明顯變化。等溫滴定微量熱結(jié)果顯示，游離態(tài)DNA、固定在去有機(jī)質(zhì)粗粘粒、含有機(jī)質(zhì)粗粘粒、高嶺石和蒙脫石表面。DNA的水解熱分別為-4.7561、-4.0553、-2.3792、-2.3647和-0.2243 mJ。上述結(jié)果表明，土壤膠體

12、和礦物可保護(hù)DNA，使之抗核酸酶的降解；在供試的土壤膠體和礦物中，高嶺石表面的DNA最易被降解，而蒙脫石表面的DNA較難降解；與去有機(jī)質(zhì)粘粒相比，含有機(jī)質(zhì)粘粒表面的DNA更難被核酸酶降解。DNA在土壤膠體或礦物表面的降解與DNA的固定強(qiáng)度及DNA構(gòu)型的變化無(wú)關(guān)，土壤中有機(jī)質(zhì)和2:1型礦物(如蒙脫石)的存在以及土壤膠體和礦物對(duì)核酸酶的吸附程度可能是固定態(tài)染色體DNA抗核酸酶降解的主要原因。 6.使用CaCl<,2>處理的大腸桿菌T

13、G1感受態(tài)細(xì)胞，系統(tǒng)區(qū)分了土壤膠體和礦物對(duì)固定態(tài)質(zhì)粒p34S DNA轉(zhuǎn)化活性和抗核酸酶降解的影響，基本明確了固定態(tài)DNA的轉(zhuǎn)化機(jī)制。不同Ca<'2+>濃度下制備了土壤膠體或礦物-質(zhì)粒p34S DNA的復(fù)合物，復(fù)合物的轉(zhuǎn)化效率隨ca<'2+>濃度的增大而增大。高嶺石表面固定態(tài)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率最低，尤其是在Ca<'2+>濃度為5-100 mM，沒(méi)有觀察到轉(zhuǎn)化子。與含有有機(jī)質(zhì)粘粒和細(xì)粘粒相比，去有機(jī)質(zhì)粘粒和粗粘粒表面固定態(tài)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

14、效率較低。加入10 ng DNase I，10μg游離質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)下降了99.8％，而土壤膠體和蒙脫石表面固定態(tài)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)僅下降了2.0％-57.8％。加入100 ng DNase I，去有機(jī)質(zhì)粘粒表面固定態(tài)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)下降了92.3％-93.8％，DNase I的量達(dá)到1000 ng時(shí)，固定態(tài)質(zhì)粒DNA完全被降解，檢測(cè)不到轉(zhuǎn)化子。對(duì)于含有機(jī)質(zhì)粘粒和蒙脫石表面質(zhì)粒DNA，即使加入2000 ng DNase I，

15、轉(zhuǎn)化子數(shù)僅下降了64.0-98.0％。固定在粗粘粒表面質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)下降比率高于細(xì)粘粒。蒙脫石、含有機(jī)質(zhì)粘粒和細(xì)粘粒對(duì)質(zhì)粒。DNA有較強(qiáng)的保護(hù)作用。質(zhì)粒DNA在土壤膠體和礦物表面的吸附親和力以及構(gòu)型的變化可能是影響固定態(tài)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化效率高低的主要因素。 7.首次利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了土壤膠體和礦物表面固定態(tài)質(zhì)粒pGEX-2T DNA中600-bp堿基對(duì)序列。土壤膠體、高嶺石或蒙脫石.質(zhì)粒DNA復(fù)合物直接用于PCR擴(kuò)增，無(wú)擴(kuò)

16、增產(chǎn)物出現(xiàn)；土壤膠體或高嶺石-DNA復(fù)合物稀釋10倍或20倍后，可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物，蒙脫石.質(zhì)粒DNA復(fù)合物即使稀釋到100倍，仍不能進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)于固定在針鐵礦表面的質(zhì)粒DNA而言，復(fù)合物在不稀釋、稀釋10倍和20倍條件下，均可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，PCR體系中粘土礦物類型和濃度顯著影響固定態(tài)質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。 8.應(yīng)用等溫微量熱技術(shù)，首次獲得了土壤膠體或礦物體系下大腸桿菌的代謝熱曲線。通過(guò)擬合指數(shù)方程，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在L