HIF-2α在低氧微環(huán)境下對結(jié)腸癌C-Myc癌基因調(diào)控研究.pdf

1、全球結(jié)腸癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤第三位，病死率居第四位。由于結(jié)直腸癌的早期缺乏特異性癥狀，一旦確診大部分已屬中、晚期。結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)為主，配合化療、放療和靶向分子治療等綜合治療手段。尋找生物學(xué)靶標(biāo)用于癌變監(jiān)測和干預(yù)是結(jié)直腸癌防治研究的一個重要方向。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的突變、抑癌基因的失活密切相關(guān)。c-Myc作為重要原癌基因在多種惡性腫瘤中都呈高表達(dá)。c-Myc基因?qū)?xì)胞具有雙重作用，可刺激細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，研

2、究c-Myc在腫瘤中的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制對結(jié)腸癌的診治有重要價(jià)值。結(jié)腸腫瘤組織生長中心區(qū)會不同程度出現(xiàn)缺氧和壞死。低氧環(huán)境對腫瘤組織的生長具有重要影響。低氧微環(huán)境參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成等調(diào)控。低氧誘導(dǎo)因子HIF廣泛表達(dá)于哺乳動物的各種組織細(xì)胞中，以促進(jìn)機(jī)體對低氧的適應(yīng)過程，是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的最主要調(diào)節(jié)因子。
　　目的：通過系統(tǒng)研究低氧微環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞株中HIF-1α/HIF-2α與c-Myc的

3、表達(dá)情況;同時利用siRNA干擾技術(shù)，了解HIF-1α/HIF-2α對c-Myc的調(diào)控作用;利用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理后結(jié)腸癌細(xì)胞低氧培養(yǎng)c-Myc蛋白的表達(dá)，以了解泛素化是否參與了c-Myc蛋白的降解過程。
　　方法：⑴不同低氧處理時間點(diǎn)，提取結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480的總蛋白，Western blot檢測HIF-1α、HIF-2α、c-Myc及p-c-Myc的表達(dá)變化。⑵不同低氧處理時間點(diǎn)，提取結(jié)腸癌細(xì)胞HCT

4、116和SW480的總RNA，qPCR險(xiǎn)測c-Myc mRNA表達(dá)的變化。低氧處理24h后，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測c-Myc啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化。⑶采用siRNA靶向干擾HIF-1α或HIF-2α的表達(dá)，低氧培養(yǎng)24h后，Westernblot檢測c-Myc蛋白表達(dá)的變化。⑷采用MG132處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480，分別常氧和低氧下培養(yǎng)，Western blot檢測c-Myc蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：①低氧微環(huán)境下結(jié)

5、腸癌細(xì)胞株中HIF-1α/HIF-2α與c-Myc蛋白表達(dá)的變化。隨低氧時間延長，HIF-1α在4h左右達(dá)到高峰，繼續(xù)延長低氧時間表達(dá)水平逐漸下降;而HIF-2α蛋白在24h表達(dá)保持持續(xù)升高。c-Myc和p-c-Myc蛋白水平隨低氧時間延長逐步減弱。②低氧微環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞株中c-Myc mRNA及轉(zhuǎn)錄活性的變化。隨著低氧處理時間的延長，結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480中的c-MycmRNA含量逐漸降低。低氧24h后c-Myc的轉(zhuǎn)錄

6、活性明顯下降。③低氧誘導(dǎo)因子對c-Myc表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480中，干擾HIF-1α或HIF-2α并低氧處理24h后，c-Myc的表達(dá)增加，且干擾HIF-2α后，c-Myc表達(dá)的增加更為明顯。④MG132對c-Myc蛋白表達(dá)的影響。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480中加入MG132預(yù)處理后c-Myc蛋白的表達(dá)明顯增加，且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：⑴慢性低氧微環(huán)境下，結(jié)腸癌細(xì)胞中HIF-2α為優(yōu)勢表達(dá)的低氧