斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)兩端標(biāo)記.pdf

1、蛋白質(zhì)標(biāo)記是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用研究中必不可少的工具?，F(xiàn)今，隨著蛋白標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，多位點(diǎn)特異性標(biāo)記蛋白質(zhì)方法在生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，尤其是在研究蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)構(gòu)像以及動(dòng)力學(xué)分析中起到了重要作用，例如單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET）。為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)多位點(diǎn)特異性標(biāo)記，目前已經(jīng)發(fā)展了多種基于化學(xué)和/或分子生物學(xué)的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法，但是各自都存在自身的缺陷，不能很好地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)多位點(diǎn)特異性標(biāo)記。
　　蛋白質(zhì)反式

2、剪接技術(shù)（protein trans-splicing）的發(fā)展為蛋白質(zhì)的標(biāo)記開(kāi)辟了新途徑。蛋白質(zhì)反式剪接反應(yīng)是由斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（split-intein）介導(dǎo)，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在蛋白質(zhì)內(nèi)含子內(nèi)部區(qū)域特定位點(diǎn)發(fā)生斷裂，形成N-端蛋白（IN）和C-端蛋白（IC），分別由基因組上相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）編碼。在蛋白質(zhì)翻譯后成熟過(guò)程中，IN和IC相互識(shí)別，重建催化活性中心，催化反式剪接反應(yīng)發(fā)生。

3、蛋白質(zhì)外顯子（exteins）通過(guò)肽鍵相連接，形成成熟的蛋白質(zhì)，IN和IC在蛋白質(zhì)成熟過(guò)程中自我剪切下來(lái)。
　　現(xiàn)今利用斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接已經(jīng)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的N和 C端的單一特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記，Yang等人2009年實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)兩端的特異性標(biāo)記。本論文利用兩種不同的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子同樣實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)兩端的特異性標(biāo)記，相比已有的標(biāo)記方法有許多優(yōu)越性，并且實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)兩端特異性同時(shí)標(biāo)記，方法優(yōu)于yang實(shí)驗(yàn)室的蛋白質(zhì)兩端特異性標(biāo)

4、記方法。
　　本課題選取 SG-S1、SX-S1、TX-S1和 TE3-S11斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，其中 S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端僅含有12個(gè)氨基酸， S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端僅含有6個(gè)氨基酸，用于重組蛋白質(zhì) N末端或 C末端熒光染料標(biāo)記。將S1型斷裂內(nèi)含子 C端和 S11型斷裂內(nèi)含子N端分別與靶蛋白diUb的N端和C端融合，形成M端前體蛋白；熒光染料FITC標(biāo)記S1型斷裂內(nèi)含子N端，形成N端前體蛋白；熒光染料Alexa59

5、4標(biāo)記S11型斷裂內(nèi)含子C端，形成C端前體蛋白。化學(xué)方法合成熒光標(biāo)記的N端前體蛋白，利用 Ni2+-NTA純化得到 M端前體蛋白和 C端前體蛋白，篩選合適的M端前體蛋白。N端前體蛋白、M端前體蛋白和 C端前體蛋白按摩爾比1：1：1進(jìn)行反式剪接反應(yīng)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件和 C端前體蛋白優(yōu)化反式剪接反應(yīng)，通過(guò)熒光掃描、SDS-PAGE和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)是否產(chǎn)生兩端特異性標(biāo)記蛋白產(chǎn)物。
　　研究結(jié)果表明，本文實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)兩端特異性同時(shí)標(biāo)記