一個(gè)組成型表達(dá)的草魚(yú)ADAR1基因剪切異構(gòu)體ADAR1a的鑒定與特征.pdf

1、作為ADAR家族中的一員，ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA)能夠?qū)㈦p鏈RNA的腺嘌呤(A)置換為次黃嘌呤(I)。在哺乳動(dòng)物中，ADAR1擁有很多剪切異構(gòu)體，包括研究較為普遍的能被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的150kD大小的剪切異構(gòu)體ADAR1-p150和組成型表達(dá)的110kD大小的剪切異構(gòu)體ADAR1-p110。ADAR1這種結(jié)構(gòu)的多樣性可能反應(yīng)了其不同剪切異構(gòu)體之間功能的多樣及差異。ADAR1不同剪切

2、異構(gòu)體也被發(fā)現(xiàn)存在于魚(yú)類(lèi)之中。在我們之前的研究中，我們已經(jīng)在草魚(yú)中克隆得到了 ADAR1兩種不同剪切異構(gòu)體CiADAR1和CiADAR1-like，它們都可以被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)。在本文中，我們鑒定了一個(gè)新的草魚(yú)ADAR1基因剪切異構(gòu)體ADAR1a。ADAR1a基因包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，它的全長(zhǎng)cDNA序列包括359bp的5'UTR，229bp的3'UTR和一個(gè)2592bp的最大ORF，編碼983個(gè)氨基酸的多肽。ADAR1a蛋白具

3、有1個(gè)Z-DNA結(jié)合域，3個(gè)dsRNA結(jié)合域和一個(gè)高度保守的水解脫氨酶激酶活性區(qū)。在草魚(yú)CIK細(xì)胞中，通過(guò)western blot分析，草魚(yú)ADAR1a蛋白表現(xiàn)出組成型表達(dá)特性并不受poly(I:C)刺激影響。在正常狀況下，草魚(yú)腎細(xì)胞中ADAR1a蛋白主要分布在細(xì)胞核，而通過(guò)poly(I:C)刺激，隨著時(shí)間推移，ADAR1a蛋白由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，其具體分子機(jī)制尚不清楚。
　　為了進(jìn)一步研究草魚(yú)ADAR1a基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，通

4、過(guò)5'full Race技術(shù)，我們確定了草魚(yú)ADAR1a的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于ADAR1基因的第二個(gè)外顯子上。然后我們克隆了其包含部分5'UTR及其上游序列在內(nèi)共1303bp作為ADAR1a基因的啟動(dòng)子，通過(guò)軟件分析，其中包含4個(gè)干擾素調(diào)節(jié)因子元件。通過(guò)構(gòu)建草魚(yú)IRF1、IRF3的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-IRF1和pcDNA3.1-IRF3與pGL3-CiADAR1a啟動(dòng)子報(bào)告載體共轉(zhuǎn)入草魚(yú)腎細(xì)胞。雙熒光素酶活性分析結(jié)果顯示在草魚(yú)腎

5、細(xì)胞中無(wú)論是草魚(yú)IRF1、IRF3蛋白還是Poly I:C都不能影響草魚(yú)ADAR1a蛋白的表達(dá)。
　　通過(guò)其分子與表達(dá)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)亞定位結(jié)果及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們推測(cè)草魚(yú)ADAR1a與哺乳動(dòng)物ADAR1蛋白剪切異構(gòu)體ADAR1-p110具有高度同源性。隨后，通過(guò)序列比對(duì)推測(cè)其核輸出信號(hào)(NES)序列，并構(gòu)建pEGFP-C1-ADAR1a，pEGFP-C1-ADAR1N，pEGFP-C1-ADAR1NΔNES表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)CI