IFNα促進(jìn)ADAR1的泛素化降解及其對(duì)IFNα抗病毒功能的調(diào)控研究.pdf

1、目的：雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）在干擾素（Interferon，IFN）的產(chǎn)生、干擾素發(fā)揮作用以及抗病毒固有免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。腺苷脫氨酶ADAR1（Adenosine Deaminase Acting on RNA1）由于其作用于雙鏈RNA的編輯作用而被廣泛關(guān)注。ADAR1作用于dsRNA，催化雙鏈結(jié)構(gòu)RNA的腺苷（adenosine）發(fā)生脫氨基而變成肌苷（inosine），使得dsRNA

2、結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，因此病毒及細(xì)胞內(nèi)的RNA都能被ADAR1所作用編輯。近年來的研究主要集中在 ADAR1如何通過抑制干擾素通路上下游的一些因子而抑制干擾素的產(chǎn)生或抑制其發(fā)揮作用，從而起到負(fù)調(diào)控干擾素抗病毒的作用，或者研究ADAR1對(duì)不同病毒起到不同調(diào)控作用的機(jī)制。然而對(duì)于干擾素是否以及如何調(diào)控ADAR1的機(jī)制還不清楚。本課題擬研究IFNα對(duì)ADAR1-p110的泛素化水平和蛋白水平的調(diào)控機(jī)制，以及該調(diào)控對(duì)于IFNα抗病毒效應(yīng)的影響。這一研

3、究旨在進(jìn)一步理解干擾素有效抗病毒信號(hào)中新的調(diào)控機(jī)制，并為臨床上增強(qiáng)干擾素抗病毒治療新藥的研發(fā)提供潛在的新靶點(diǎn)。
　　方法：用 IFNα處理 HEK293T細(xì)胞以及過表達(dá) Flag-ADAR1-p110的HEK293T細(xì)胞，用免疫印跡檢測(cè)IFNα對(duì)內(nèi)、外源性ADAR1-p110蛋白水平的影響。進(jìn)一步檢測(cè)IFNα對(duì)ADAR1-p110蛋白的影響是否依賴于泛素化。接下來鑒定ADAR1-p110泛素化過程中的E3連接酶，以及IFNα對(duì)AD

4、AR1-p110與其E3相互作用的影響。最后用免疫印跡及流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)IFNα對(duì)ADAR1-p110的降解對(duì)IFNα有效抗VSV病毒效應(yīng)的影響。
　　結(jié)果：⑴ADAR1-p110抑制了IFNα介導(dǎo)的抗病毒功能。⑵IFNα能夠誘導(dǎo)ADAR1-p110的降解，并且具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。⑶IFNα誘導(dǎo)了ADAR1-p110的泛素化增加，并且具有劑量依賴效應(yīng)，且IFNα誘導(dǎo)了ADAR1-p110發(fā)生48位賴氨酸（K48）泛素化修飾，而

5、63位賴氨酸（K63）泛素化修飾水平則無明顯變化。⑷SCFβ-TrCP是ADAR1的E3連接酶，且ADAR1-p110上的“DSG（XX)n+2S”序列在β-TrCP對(duì)其特異性識(shí)別中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。⑸IFNα誘導(dǎo)ADAR1-p110的泛素化依賴于β-TrCP，IFNα能夠增強(qiáng)兩者的相互作用。⑹ADAR1-p110序列上的第574和576位賴氨酸是 IFNα誘導(dǎo)ADAR1-p110發(fā)生泛素化的主要泛素結(jié)合位點(diǎn)。⑺IFNα對(duì)ADAR1-p1