SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究.pdf

1、SAMHD1是近年來新發(fā)現(xiàn)的抗艾滋病毒的天然蛋白質(zhì)分子，在髓系來源的樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和靜息CD4+T細(xì)胞中，發(fā)揮dNTPase功能，通過降低胞內(nèi)dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復(fù)制。此外，HIV-2和一些SIV編碼的Vpx蛋白，可以通過加載SAMHD1到CRL4DCAF1E3泛素連接酶上誘導(dǎo)SAMHD1蛋白酶體降解，通過降解SAMHD1促進(jìn)HIV-1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的積累，明顯促進(jìn)人的單核細(xì)胞及其來源的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的感染。

2、本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了恒河猴中不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗病毒功能、CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性以及SHIVSF162P3感染恒河猴體內(nèi)samhd1mRNA的變化等，以期進(jìn)一步完善對(duì)SAMHD1蛋白抗病毒功能的認(rèn)知。
　　第一部分 不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗病毒功能的研究。前期在中國(guó)恒河猴中對(duì)SAMHD1蛋白進(jìn)行了大樣本篩查，共篩查出5個(gè)非同義cSN

3、P位點(diǎn)，均在群體中占有較高的頻率。其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性的HD結(jié)構(gòu)域上;S107L分布在參與蛋白-蛋白或蛋白-RNA相互作用的SAM結(jié)構(gòu)域上。用軟件對(duì)這5個(gè)SNP位點(diǎn)的SAMHD1二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能影響進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。發(fā)現(xiàn)了其中G183S、E184D、V280A這三個(gè)位點(diǎn)最有可能影響蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上，這三個(gè)位點(diǎn)所處的HD結(jié)構(gòu)域發(fā)生了一個(gè)α螺旋到β片層的轉(zhuǎn)變，一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)也因?yàn)?/p>

4、這三個(gè)cSNP的出現(xiàn)而發(fā)生了移位;在三級(jí)結(jié)構(gòu)上，V280A正好處于蛋白質(zhì)活性中心（凹槽部位）的袋口處，類似于盒蓋的結(jié)構(gòu)上，可能會(huì)影響到SAMHD1的磷酸水解酶催化活性。Si07L位于SAMHD1敏感性的位點(diǎn)，可能影響病毒Vpx蛋白結(jié)合，說明此位點(diǎn)也有較大可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。D5E未分布于重要的蛋白結(jié)構(gòu)域上，目前還沒有能改變蛋白功能的證據(jù)支持，但也有文獻(xiàn)報(bào)道，SAMHD1蛋白的N端能夠與艾滋病毒相互作用，所以有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

5、r>　　本研究中，我們分別使用5種SNP位點(diǎn)突變的samhd1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染TZM-bl細(xì)胞，再用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞滴定HIV假病毒和SIV的病毒滴度，以驗(yàn)證5種SNP位點(diǎn)突變的SAMHD1蛋白抗病毒功能的大小。結(jié)果表明，不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗HIV病毒作用確實(shí)有些不同。其中，D5E、G183S、V280A三個(gè)位點(diǎn)突變的samhd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的samhd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的的病毒滴定結(jié)果一致;S107L位點(diǎn)的突變使得TCID5

6、0的值比對(duì)照降低了10倍，發(fā)揮了比其他5個(gè)位點(diǎn)突變更高的抗病毒作用;E184D位點(diǎn)的突變，測(cè)出的TCID50的值比對(duì)照TZM-bl細(xì)胞的值高，說明轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的基因可能沒有發(fā)揮抗病毒功能反而還影響了正常細(xì)胞內(nèi)的抗病毒蛋白發(fā)揮作用。與之相反，分別用轉(zhuǎn)染六種不同samhd1基因的TZM-bl細(xì)胞滴定SIVmac239病毒得到的TCID50的值都是一樣的。說明不同SNP的SAMHD1蛋白抗SIVmac239的作用差異較小，對(duì)病毒的最終滴度影響

7、不大。這應(yīng)該與SIVmac239編碼的Vpx蛋白有關(guān)。這也說明，由于SIV病毒中Vpx蛋白的存在，SIV感染恒河猴不同個(gè)體間出現(xiàn)的疾病進(jìn)程的差異應(yīng)該與恒河猴體內(nèi)的SAMHD1蛋白沒有太大關(guān)系，更與SAMHD1蛋白的不同的SNP位點(diǎn)無關(guān)。
　　第二部分 CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性研究。SAMHD1蛋白作為限制因子，在髓系樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和靜息CD4+T細(xì)胞中，發(fā)揮dNTPase功能

8、，通過降低胞內(nèi)dNTP水平，阻止HIV-1病毒早期復(fù)制，但在感染的活化CD4+T細(xì)胞中，是否發(fā)揮抗病毒作用卻知之甚少。
　　本研究中，CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239病毒后，隨著培養(yǎng)上清中的病毒載量快速升高，細(xì)胞中病毒P27蛋白的表達(dá)水平也增加迅速。而samhd1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在4天后顯著增加，與病毒載量呈正相關(guān)，可見細(xì)胞在感染過程中，上調(diào)了samhd1基因的表達(dá);與之相反的是細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)量從4天后逐漸

9、下降，第5-6天時(shí)基本檢測(cè)不到，與SIV病毒P27蛋白量呈顯著負(fù)相關(guān)。SAMHD1蛋白表達(dá)量的降低，可能與SIVmac239病毒產(chǎn)生的Vpx蛋白降解SAMHD1蛋白有關(guān)。SAMHD1蛋白在活化的細(xì)胞中是否發(fā)揮抗病毒的功能有待進(jìn)一步證實(shí)，但本研究中發(fā)現(xiàn)感染SIV的CEMx174細(xì)胞samhd1基因上調(diào)，蛋白含量下降，說明SAMHD1在感染過程中是起作用的。廣譜表達(dá)的SAMHD1蛋白可能具有廣譜的抗病毒作用，不只是在靜息CD4+T細(xì)胞或髓系

10、細(xì)胞中發(fā)揮作用。
　　第三部分 SHIVSF162P3感染恒河猴體內(nèi)samhd1 mRNA表達(dá)量的變化。在SIV病毒感染的恒河猴研究中，Bianka Mubil等人發(fā)現(xiàn)，在緩慢進(jìn)展型疾病進(jìn)程中以及病毒載量水平較低的恒河猴體內(nèi)，同SAMHD1同樣具有抗病毒作用的APOBEC3G(A3G)和APOBEC3F(A3F)蛋白在mRNA水平上表達(dá)量是增加的。那么，SAMHD1蛋白在SIV/SHIV感染猴體內(nèi)，在mRNA水平上的表達(dá)量是否隨著

11、病毒載量的變化也會(huì)有所變化？是否在恒河猴體內(nèi)發(fā)揮抗病毒的功能？
　　本研究以SHIVSF162p3病毒靜脈感染4只中國(guó)恒河猴，均成功感染，其中一只表現(xiàn)出快速進(jìn)展型疾病特征。
　　我們首先利用相對(duì)定量的方法檢測(cè)了感染恒河猴外周血PBMC細(xì)胞中的samhd1基因相對(duì)于內(nèi)參基因gapdh表達(dá)量的變化。發(fā)現(xiàn)除了快速進(jìn)展型的G0822V外，其余3只恒河猴的samhd1 mRNA水平均隨著病毒載量的升高而升高;快速進(jìn)展型的G0822V卻

12、正好相反，伴隨著始終高水平的病毒載量，水平反而呈現(xiàn)向下波動(dòng)的趨勢(shì)。我們認(rèn)為，samhd1 mRNA表達(dá)量可能與疾病進(jìn)程相關(guān)，快速進(jìn)展型及高水平病毒載量下調(diào)samhd1基因的表達(dá)。
　　為了更直觀地顯示表達(dá)量的變化，本研究中我們還建立了用標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)samhd1基因mRNA水平的方法。研究中發(fā)現(xiàn)，在感染急性期病毒載量增加的過程中，samhd1 mRNA表達(dá)水平均略有下降，急性期后伴隨著載量的降低又恢復(fù)到正常水平。由此我們認(rèn)