E3連接示功圖TRIP通過降解TBK1負向調控IFn-β的產生和抗病毒免疫反應.pdf

1、天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，也是激活適應性免疫的基礎，在宿主清除病毒的免疫反應中具有關鍵作用，因此成為當前免疫學研究的熱點。天然免疫應答就是病原微生物感染機體后，首先通過模式識別受體（pattern-recognition receptor,PRR）識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，從而激活一系列信號通路，誘導包括IRF3和NF-κB在內的轉錄因子

2、的活化入核，協(xié)同促進Ⅰ型干擾素、炎癥因子等多種細胞因子的表達和分泌。Ⅰ型干擾素通過與細胞膜上的干擾素受體相互作用，誘導一系列抗病毒蛋白的表達，這些抗病毒蛋白協(xié)同作用，通過抑制病毒復制或誘導被感染細胞的凋亡，實現(xiàn)細胞的抗病毒反應。炎癥因子所引發(fā)的炎癥反應能夠激活天然免疫細胞，并誘導適應性免疫應答的啟動。由此可見，Ⅰ型干擾素等細胞因子對機體的抗病毒免疫反應具有至關重要的作用。而在眾多信號通路中以Toll樣受體(Toll-like recep

3、tors，TLRs)和維甲酸誘導的基因Ⅰ樣受體(Retinoic acid-induced gene(Ⅰ)like receptors，RLRs)所介導的信號轉導通路最為熱點。
　　 E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)是一種具有調節(jié)目的蛋白泛素化水平的分子，通常以K48偶聯(lián)的泛素化方式促進目的蛋白通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，或者通過K63偶聯(lián)的泛素化促進目的蛋白的活化。目前已有報道顯示E3可以通過調節(jié)TLR和RL

4、R通路中的多個信號分子的降解或者活化從而調節(jié)并平衡免疫應答。如TRIM30a、TRIM21、Triad3A、A20、RNF5、RNF125、AIP4以及PSMA等可通過K48泛素化形式降解相應接頭蛋白，進而負向調節(jié)信號通路。關于E3連接酶如何參與到抗病毒的信號通路中已成為當今科學研究領域中的重要話題。
　　 一.研究目的:
　　 前期研究發(fā)現(xiàn)TRIP(TRAF-interacting Protein)在TNF-α介導的N

5、F-κB信號轉導途徑中發(fā)揮著重要調節(jié)作用，并認為TRIP通過阻斷TNFR與TRAF2的結合的方式負向調節(jié)信號通路;又有報道稱TRIP具有體外泛素化功能，但關于其靶點卻沒有相關報道。因此TRIP是否參與到TLR和RLR所介導的Ⅰ型干擾素的產生過程中，并且是否通過其泛素化功能起到相應作用都不得而知。
　　 二.研究方法:
　　 1.TLR信號通路對TRIP的調控
　　 1.1、TLR對TRIP的表達影響
　　

6、 用TLR4的配體LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞，在刺激的不同時間點收獲RNA和蛋白，利用RT-PCR及Western Blotting方法，檢測LPS刺激后TRIP在RNA水平和蛋白水平上的變化。
　　 1.2、TRIP在細胞內的定位
　　 將TRIP構建到含F(xiàn)LAG標簽和GFP標簽的表達載體上，將表達載體轉染HEK293，利用免疫熒光技術檢測TRIP在細胞內的定位。
　　 1.3、TLR對TRIP細胞內定位的

7、影響
　　 用TLR4的配體LPS刺激巨噬細胞系RAW264.7，在不同時間點收獲細胞。將細胞漿蛋白和細胞核蛋白分別提取，利用Western Blotting方法，檢測LPS刺激后TRIP在細胞內的定位是否發(fā)生變化。
　　 2.TRIP負向調控TLR及RLR介導的IFN-β的產生
　　 2.1、TRIP對TLR3/4介導的IFN-β產生的的影響
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRI

8、P進行干擾，或者將TRIP超表達質粒轉染HEK293-TLR3細胞系，用TLR3的配體Poly(I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激細胞，利用RT-PCR，ELISA及報告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報告基因活性水平的變化，探討TRIP對TLR介導的信號信號通路的影響。
　　 2.2、TRIP對RIG-Ⅰ介導的IFN-β產生的的影響
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行

9、干擾，或者TRIP超表達質粒轉染HEK293細胞系，用Sev感染細胞系或者Poly(I:C)轉染細胞系，活化RIG-Ⅰ信號通路，分別用RT-PCR，ELISA和報告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報告基因活性水平的變化，探討TRIP對RLR介導的信號信號通路的影響。
　　 3.TRIP調控IFN-β表達的分子機制
　　 3.1、TRIP對轉錄因子IRF3活性的影響
　　 將TRIP超表達質粒轉染H

10、EK293細胞系，再用Sev感染細胞系或者poly(I:C)轉染細胞系，檢測IRF3的磷酸化，二聚化以及報告基因活性的變化，探討TRIP過表達后對RLR介導的IRF3活化的影響。
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行干擾，用TLR3的配體Poly(I:C)和TLR4的配體LPS分別刺激，利用Western Blotting方法，檢測TRIP干擾后對LPS及Poly(I:C)介導的IRF3活化的影響。

11、
　　 3.2、TRIP靶點的尋找
　　 將TLR，RLR信號通路中的TRIF,RIG-Ⅰ，MDA5，MAVS，TBK1,IRF3等接頭蛋白表達載體與TRIP過表達載體共轉染HEK293，利用RT-PCR及報告基因技術檢測TRIP對不同接頭蛋白所介導的IFN-βmRNA表達及報告基因活性的影響。
　　 3.3、TRIP對接頭蛋白的降解
　　 篩選高表達TRIP的RAW264.7穩(wěn)定細胞株或者用干擾RNA將

12、小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行干擾，用LPS刺激細胞不同時間點，收獲蛋白，用TRAF3，TRAF6，IRF3，STAT1等特異性抗體做WesternBlotting，探究TRIP對各個接頭蛋白內源性表達量的影響。
　　 將TLR，RLR信號通路中TRAF3，TBK1，IRF3等接頭蛋白的表達載體與TRIP的表達載體共轉染HEK293，Western Blotting的方法探究TRIP對各個接頭蛋白的表達量影響，并加入蛋白酶體

13、抑制劑MG132，觀察TRIP的降解作用是否消失。
　　 3.4、TRIP對接頭蛋白的泛素化
　　 將TRIP表達載體，接頭蛋白表達載體與泛素表達載體一同轉染HEK293，加入蛋白酶體抑制劑MG132，用接頭蛋白抗體做免疫共沉淀，用泛素抗體進行Western Blotting，探討TRIP是否對接頭蛋白進行泛素化。
　　 將TRIP表達載體，接頭蛋白表達載體與野生型泛素表達載體，K48位點突變泛素表達載體，K63

14、位點突變泛素表達載體一同轉染HEK293，用接頭蛋白對應抗體做免疫共沉淀，用泛素標簽抗體進行Western Blotting，探討TRIP對接頭蛋白的泛素化形式。
　　 4.TRIP抵抗病毒的生理意義
　　 4.1、TRIP對病毒介導的IFN-β的影響
　　 將TRIP超表達質粒轉染HEK293細胞系，用Sev感染細胞，使用RT-PCR，ELISA技術檢測TRIP對IFN-β產生的影響;報告基因檢測TRIP對IF

15、N-β，IRF3活性的影響;WesternBlotting檢測TRIP對IRF3二聚化的影響，及對接頭蛋白降解的影響。
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行干擾，用Sev感染細胞，重復上面的實驗，探究干擾TRIP后是否具有相反的作用
　　 4.2、TRIP對病毒增殖復制影響
　　 將TRIP超表達質粒轉染HEK293細胞系，24小時后轉染Poly(I:C)，靜置培養(yǎng)6小時并加入VSV

16、，第二天收集上清及細胞mRNA，利用病毒空斑實驗及RT-PCR技術，檢測病毒的數量。
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行干擾，重復上面的實驗，探究干擾TRIP后是否具有相反的作用。
　　 三.實驗結果
　　 1.TLR信號通路對TRIP的調控
　　 1.1、TLR促進TRIP的表達
　　 我們?yōu)榱颂接慣RIP是否參與TLR信號通路中，首先用TLR4的配體LPS刺激小

17、鼠腹腔原代巨噬細胞，通過RT-PCR及Western Blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)，從LPS刺激4小時開始，TRIP的表達量逐漸增加，在12到16小時時達到高峰，LPS刺激24小時后TRIP的水平又有所恢復，用TLR3的配體Poly(I:C)刺激或者RIG-Ⅰ的配體Sev感染細胞后，TRIP的表達量也發(fā)生同樣的變化。這說明TRIP有可能參與到TLR及RLR介導的信號轉導中。
　　 1.2、TRIP主要定位于細胞漿
　　

18、由于很多文獻報道的TRIP的定位差距較大，有人認為TRIP分布在胞核，有人認為TRIP在胞質，TRIP的定位對于其之后的功能研究而言至關重要，因此我們通過免疫熒光的方法檢測TRIP的細胞定位，用FLAG-TRIP轉染HEK293，24小時后，進行免疫熒光實驗，用抗FLAG的熒光二抗孵育細胞，在488nm波長激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)TRIP即分布在胞核又分布在胞漿，且在胞漿的量遠遠大于在胞核中的量，另外我們觀察到一個有趣的現(xiàn)象，即TRIP在胞漿

19、中成散點狀分布，這與TBK1的分布極其相似，這也為之后的靶點尋找提供了一個依據。另外我們構建了GFP標簽的TRIP表達載體，將其轉染到HEK293細胞系中，直接用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)相同現(xiàn)象。
　　 1.3、TLR不影響TRIP在細胞內定位
　　 將RAW264.7鋪小平皿，靜置培養(yǎng)16-24h，LPS或Poly(i:c)刺激30min，60min，提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白，調節(jié)濃度后進行Western Blottin

20、g，結果顯示LPS或Poly(I:C)刺激細胞后，RAW264.7細胞中TRIP并沒有出現(xiàn)出核或入核情況。由于TRIP主要位于細胞漿中，且刺激后沒有發(fā)生明顯入核，說明TRIP可能主要作用于胞漿蛋白。
　　 2.TRIP負向調控TLR及RLR介導的IFN-β的產生
　　 2.1、TRIP抑制TLR3/4介導的IFN-β產生
　　 為進一步驗證TRIP是否參與到TLR3/4介導的IFN-β的影響，我們構建了TRIP的

21、表達載體，并在公司合成了小鼠TRIP的干擾RNA。在HEK293細胞系中轉染TRIP的表達載體，進行WesternBlotting，用相應標簽(FLAG,Myc)抗體孵育，發(fā)現(xiàn)TRIP表達良好。用淀粉誘導C57小鼠的巨噬細胞，轉染TRIP的干擾RNA，進行Western Blotting，用TRIP特異性抗體孵育，發(fā)現(xiàn)TRIP干擾RNA的干擾效率很高。將TRIP干擾后的小鼠巨噬細胞用LPS，Poly(I:C)刺激細胞，通過RT-PCR及

22、ELISA分別檢測IFN-β的mRNA水平及分泌水平的變化，結果顯示，進行干擾TRIP后，LPS，Poly(I:C)刺激的IFN-β的mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯升高，這預示著TRIP可以負向調控TLR3/4介導的IFN-β的產生。
　　 為驗證超表達TRIP后對TLR通路介導的IFN-β的產生是否有相反的效果，由于HEK293沒有TLR，因此我們選用了293-TLR3細胞系，轉染TRIP表達質粒24h，加Poly(I:C)

23、刺激，即刻活化TLR3信號通路，同時轉染IFN-β報告基因，發(fā)現(xiàn)超表達的TRIP會抑制IFN-β的報告基因活性。
　　 2.2、TRIP抑制RIG-Ⅰ介導的IFN-β產生
　　 用Poly(I:C)轉染HEK293的方法可以模擬活化RIG-Ⅰ信號通路，因此我們在HEK293中轉染TRIP超表達載體，發(fā)現(xiàn)TRIP會抑制轉染Poly(I:C)所介導的IFN-β的產生。RAW264.7細胞系瞬時轉染iNOS，GAS報告基因，用

24、IFN-γ刺激細胞，活化IFN信號通路，發(fā)現(xiàn)高表達的TRIP對IFN-γ介導的信號通路沒有影響，這也說明了TRIP對TLR和RLR信號通路的影響具有一定的特異性。
　　 用轉染小干擾RNA的方法將小鼠腹腔原代巨噬細胞的TRIP進行干擾，用Sev感染細胞，活化RIG-Ⅰ信號通路，分別用RT-PCR，ELISA和報告基因方法檢測IFN-β的mRNA水平，分泌水平及報告基因活性水平的變化。結果顯示干擾TRIP后，Sev介導的IFN-β

25、的產生量明顯升高。
　　 3.TRIP調控IFN-β的分子機制
　　 3.1、TRIP負向調控轉錄因子IRF3活性
　　 IRF3是TLR，RLR活化產生IFN-β的最重要的轉錄因子，所以我們想探討TRIP會不會影響IRF3的活性，進而影響IFN-β的產生。首先利用報告基因技術，將IRF3的報告基因與TRIP超表達質粒共轉染RAW264.7，用LPS，Poly(I:C)刺激活化TLR3/TLR4信號通路，或者將I

26、RF3報告基因與TRIP超表達共轉染HEK293，然后在轉染Poly(I:C)的方法活化RIG-Ⅰ信號通路，發(fā)現(xiàn)TRIP會抑制TLR及RLR介導的IRF3報告基因活性。將RIG-Ⅰ，MAVS及TBK1的超表達載體與IRF3報告基因共轉染HEK293，活化IRF3報告基因，發(fā)現(xiàn)超表達的TRIP會抑制IRF3的報告基因活性，這一方面說明TRIP會負向調控RLR介導的IRF3活性，另一方面說明，TRIP的作用靶點在TBK1或者更下游位置。

27、r>　　 進而我們想探討TRIP會不會影響IRF3磷酸化情況，首先我們轉染TRIP超表達質粒于HEK293中，然后轉染Poly(I:C)活化RLR信號通路，檢測蛋白磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)超表達TRIP可以降低RLR信號通路介導的IRF3磷酸化水平。將TRIP干擾RNA轉染小鼠腹腔巨噬細胞，36小時后，用Poly(I:C)刺激細胞，觀察磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后TLR3介導的IRF3磷酸化水平明顯升高。
　　 3.2、TRIP的作

28、用靶點為TBK1
　　 為了確定TRIP在TLR及RLR信號通路中的作用靶點，我們將RIG-Ⅰ-，MAVS-，TBK1-，TRIF-及MDA5的表達載體與TRIP的表達載體共轉染HEK293，通過RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)TRIP負向調控這些接頭蛋白介導的IFN-β的rnRNA表達水平。同樣將RIG-Ⅰ-，MAVS-，TBK1-，TRIF-，MDA5，及IRF3-5D的表達載體與TRIP的表達載體和IFN-β報告基因的表達載體共同轉染

29、HEK293，報告基因結果表明，TRIP負向調控除IRF3以外的所有接頭蛋白介導的IFN-β的報告基因活性。以上結果說明了TRIP的作用靶點可能是TBK1而非IRF3。
　　 3.3、TRIP將TBK1進行特異性的降解
　　 因為TRIP具有降解作用，但TRIP的作用靶點還不得而知，因此我們首先在腹腔原代巨噬細胞中將TRIP進行干擾，分別用LPS，Poly(I:C)刺激細胞，進行Western Blotting，結果發(fā)現(xiàn)

30、對TRIP進行干擾后，內源性TBK1的表達量明顯升高，而IRF3，TRAF3，STAT1的表達并未受到影響。相反的，我們利高表達TRIP質粒的RAW264.7穩(wěn)定株，重復上面的實驗，結果發(fā)現(xiàn)高表達TRIP后，TBK1的表達量明顯降低，而TRAF3，TRAF6表達無變化。這說明在免疫細胞中，TRIP具有特異性降解TBK1的作用。將TBK1表達載體與TRAF3表達載體分別與TRIP表達載體共轉染HEK293，發(fā)現(xiàn)超表達的TRIP可以抑制TB

31、K1載體的表達，而對TRAF3載體的表達沒有影響，當加入蛋白酶體抑制劑后TRIP對TBK1載體表達的抑制作用消失。為了確定TBK1的激酶活性會不會因為降解而發(fā)生變化，我們進行了激酶檢測實驗，結果證明對TRIP進行干擾后LPS介導的TBK1激酶活性的發(fā)生明顯增強。以上結果說明TBK1是TRIP的降解靶點，TBK1的激酶活性也因此受到TRIP的負向調控。
　　 3.4、TRIP將TBK1進行K48位的泛素化
　　 泛素化是機

32、體內常見的一種蛋白質修飾形式，在TLR及RLR信號通路中發(fā)揮著重要的功能，K48位泛素化可以將目的蛋白進行特異性的蛋白酶體方式降解。TRIP含有鋅指結構域，之前也有文章預測其可能具有E3泛素連接酶功能，根據上面的降解實驗，我們猜測TRIP可能會將TBK1進行K48位泛素化。E3連接酶將目的分子泛素化的的前提是兩個分子發(fā)生結合，因此，首先我們將TBK1表達載體，IRF3表達載體與TRAF3表達載體分別與TRIP表達載體共轉染HEK293，

33、免疫共沉淀實驗結果發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TRAF3，TBK1發(fā)生結合。將RAW264.7用LPS刺激后，用TBK1特異性抗體做免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)TRIP可以與TBK1發(fā)生內源性結合.由于TRIP僅對TBK1進行降解，對TRAF3沒有作用，因此我們猜測，TRIP的泛素化靶點應該是TBK1.
　　 我們要進一步確定TRIP是否能將TBK1進行泛素化，首先我們將野生型TRIP，E3連接酶活性缺失點突變TRIP與TBK1表達載體，泛素表達載體

34、共轉染HEK293，免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)，TRIP可以將TBK1進行泛素化。進一步要證明泛素化以何種形式進行，我們將TRIP表達載體，TBK1表達載體分別于野生型泛素表達載體，K48位點突變泛素表達載體，K63位泛素表達載體共轉染HEK293，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，TRIP可以將TBK1進行K48位泛素化而非K63位泛素化。
　　 4.TRIP抵抗病毒的生理意義
　　 4.1、TRIP抑制病毒介導的IFN-β的產生
　　

35、IFN-β在機體抵抗機體抵抗病的的重要分子，前面已經證明TRIP可以負向調控RIG-1介導的IFN-β的產生，那么TRIP會不會影響病毒介導的IFN-β的產生，進而影響VSV的復制？首先將TRIP過表達載體轉染HEK293，進而用Sev感染細胞活化IFN-β的產生，RT-PCR及ELISA結果顯示，TRIP過表達可以負向調控Sev介導的IFN-β及RANTES的產生。在HEK293中利用共轉染及報告基因技術，我們可以看到TRIP可以負向

36、調控Sev介導的IFN-β報告基因活性。而將TRIP在小鼠腹腔原代巨噬細胞中進行干擾后，再用Sev感染，結果發(fā)現(xiàn)干擾TRIP后Sev介導的IFN-β的產生明顯升高。將TRIP在HEK293中進行過表達，Sev感染后進行非變性電泳，結果發(fā)現(xiàn)過表達TRIP會抑制IRF3的二聚化。在HEK293中轉染TRIP超表達載體，用Sev刺激時間點，WesternBlotting結果顯示，干擾TRIP可以促進內源性TBK1的表達，磷酸激酶實驗同樣證明T

37、RIP可以降低TBK1的激酶活性。這些結果說明TRIP可以負向調控Sev介導的IFN-β的產生。
　　 4.2、TRIP促進病毒的逃逸
　　 前面一系列結果展示了TRIP可以影響病毒介導的IFN-β的產生，我們想探討TRIP是否可以直接調節(jié)病毒的復制。我們選用了VSV病毒，該病毒同Sev一樣是單鏈RNA病毒，可以活化RIG-Ⅰ介導的IFN-β，且更適用于病毒空斑實驗研究。首先將TRIP過表達載體轉染HEK293，24小時

38、后，用Poly(I:C)轉染HEK293，6小時后用VSV感染，培養(yǎng)24小時收集上清及細胞RNA，結果顯示，過表達TRIP可以直接促進VSV的復制，而TRIP的E3連接酶活性缺失突變體則失去這一功能。將TRIP的干擾RNA轉染小鼠腹腔巨噬細胞，36小時后用Poly(I:C)刺激細胞，6小時后再用VSV感染，24小時后收集上清及細胞RNA,結果顯示，將TRIP進行干擾后可以直接抑制VSV的復制。
　　 四.結論及創(chuàng)新性
　　

39、 1.世界上首次證明TBK1的K48位泛素化調控方式
　　 TBK1是固有免疫信號通路中非常重要的一員，通過其磷酸激酶活性調控大量基因的表達，TBK1激酶活性是如何調控的還不太清楚。已有文獻報道，TBK1可以被磷酸化或K63位泛素化，進而促進TBK1及活化，但TBK1如何被負向調控至今仍未有報道，我們首次證明TBK1可以被TRIP進行K48位泛素化，進而發(fā)生降解，完善了RLR及TLR的信號轉導過程。
　　 2.首次證明

40、了TRIP具有體內泛素化功能
　　 已有報道對TRIP的結構功能進行了預測，猜測TRIP是一種E3泛素連接酶，并進行了體外泛素化驗證，但TRIP是否在體內具有泛素化功能，其作用靶點是什么都還不知道，我們的研究證明TRIP在體內的確是一種E3連接酶，并通過其泛素化功能調節(jié)TLR劑RLR信號通路。
　　 3.揭示了一條新的病毒逃逸機制
　　 病毒感染機體后，機體會對病毒殺傷，而病毒也會產生抵抗機體的逃逸機制，兩種作用

41、相互抗衡。我們研究發(fā)現(xiàn)單鏈RNA病毒感染機體后產生IFN-β殺傷病毒，同時病毒會誘導機體高表達TRIP，高表達的TRIP負反饋調控RLR及TLR信號通路，關閉IFN-β的生成，促進病毒的逃逸。
　　 4.為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的靶點
　　 目前全世界病毒泛濫，如HBV，HIV，SARS以及剛剛發(fā)現(xiàn)的H7N9等，因此生產研發(fā)針對病毒的藥物迫在眉睫，通過我們的研究，可以提出一個假設:如果我們篩選出一種可以特異性降低TRI