胞內(nèi)形式OPN通過(guò)穩(wěn)定TRAF3正向調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng).pdf

1、固有免疫系統(tǒng)作為機(jī)體抵御外界病原體入侵的首道防線，不僅可以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，同時(shí)也可以直接對(duì)入侵的病原體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，從而殺傷病原體。在病毒入侵時(shí)，固有免疫系統(tǒng)可以激活產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中最主要的是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)。固有免疫系統(tǒng)中的多種的模式識(shí)別受體(PRRs)都與Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生相關(guān)，包括諸如Toll樣受體(TLRs)，RIG-Ⅰ樣受體(RLRs)和內(nèi)源性DNA感受器等。產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素可以進(jìn)而與其受體結(jié)合，活化J

2、AK(Janus kinase)和STAT(Signaltransducers and activators of transcription)信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)IFN-stimulated genes(ISGs)的表達(dá)，最終清除病毒。
　　骨橋蛋白(osteopontin，OPN)又稱為早期T淋巴細(xì)胞活化因子1(early T lymphocyteactivation1,Eta1)，是一種分泌性的多功能糖蛋白。OPN可以調(diào)節(jié)多種

3、生物體進(jìn)程，包括細(xì)胞分化、粘附、骨重構(gòu)、惡性腫瘤和免疫反應(yīng)。長(zhǎng)期以來(lái)，OPN被認(rèn)為是一個(gè)與炎癥過(guò)程有關(guān)的潛在的促炎癥細(xì)胞因子，具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-12的作用。近年來(lái)，隨著胞內(nèi)形式OPN(iOPN)的發(fā)現(xiàn)，OPN在不同免疫細(xì)胞以及免疫反應(yīng)的不同階段中的不同調(diào)控作用逐漸引起人們的重視。而iOPN在固有免疫系統(tǒng)當(dāng)中尤其是抗病毒免疫當(dāng)中的作用還未明確。
　　目的:
　　探討OPN，尤其是iOPN是否可以調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)

4、的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。如若可以調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，闡述其潛在機(jī)制。
　　方法:
　　1.首先檢測(cè)不同病毒及刺激劑對(duì)OPN表達(dá)的影響。再利用OPN缺陷型(Spp1-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，經(jīng)病毒刺激后，檢測(cè)IFNβ以及下游多種代表性ISGs的mRNA水平變化、蛋白分泌水平變化等。通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng)型OPN(full length OPN)及胞內(nèi)形式OPN(iOPN)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)

5、告基因，檢測(cè)兩種不同形式OPN對(duì)于調(diào)節(jié)RNA病毒SeV所活化的IFN表達(dá)的影響，并檢測(cè)iOPN質(zhì)粒對(duì)于各種接頭分子所活化的IFN啟動(dòng)子區(qū)活性的調(diào)節(jié)作用。
　　2.利用OPN缺陷型(Sppl-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠，通過(guò)腹腔注射VSV病毒，檢測(cè)VSV病毒在小鼠臟器中的滴度與含量，反應(yīng)兩類小鼠對(duì)于VSV病毒的抵抗能力的區(qū)別。
　　3.通過(guò)利用OPN缺陷型(Spp1-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以及iOPN

6、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)經(jīng)SeV刺激后，重要的IFN轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活化水平變化。
　　4.經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)iOPN質(zhì)粒的靶點(diǎn)分子，并經(jīng)免疫共沉淀(co-IP)以及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)iOPN與靶點(diǎn)分子的結(jié)合情況。
　　5.明確靶點(diǎn)分子后，利用不同類型的泛素分子質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染iOPN及靶點(diǎn)分子進(jìn)HEK293細(xì)胞，檢測(cè)其是否發(fā)生泛素化水平的變化，以及靶點(diǎn)分子的穩(wěn)定性是

7、否發(fā)生變化。
　　6.靶點(diǎn)分子若發(fā)生K48位泛素化水平的變化以及其穩(wěn)定性若發(fā)生變化，說(shuō)明iOPN可能可以調(diào)節(jié)靶點(diǎn)分子的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)已知的泛素化酶以及去泛素化酶進(jìn)行篩選，尋找可能的作用機(jī)制，并通過(guò)細(xì)胞水平以及體外翻譯系統(tǒng)對(duì)結(jié)論進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性確認(rèn)。
　　7.通過(guò)利用細(xì)胞過(guò)表達(dá)載體以及慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建iOPN-WT、iOPN-N、iOPN-C重組過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)或?qū)PN缺陷型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行iOPN回補(bǔ)實(shí)

8、驗(yàn)，明確iOPN具體發(fā)生功能的區(qū)域。
　　結(jié)果:
　　1.首先，在利用RNA病毒VSV（水泡性口炎病毒）、SeV（仙臺(tái)病毒）以及DNA病毒HSV（單純皰疹病毒）等病毒刺激野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)OPN的表達(dá)都有逐漸升高的趨勢(shì);其次，在OPN缺陷型小鼠以及野生型小鼠巨噬細(xì)胞中加入SeV或VSV刺激不同時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)相比較于野生型組，OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFNβ的能力都明顯降低;將構(gòu)建成功的全長(zhǎng)型OPN

9、表達(dá)載體與iOPN表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293后經(jīng)SeV刺激后，發(fā)現(xiàn)二種質(zhì)粒都可以使IFNβ表達(dá)增強(qiáng)，但是iOPN表達(dá)載體組明顯強(qiáng)于全長(zhǎng)型OPN表達(dá)載體組，并且利用OPN封閉抗體封閉分泌型OPN后，IFNβ的產(chǎn)生無(wú)明顯變化，說(shuō)明全長(zhǎng)型OPN所表達(dá)的分泌性O(shè)PN可能并不參與調(diào)節(jié)IFNβ的增強(qiáng)過(guò)程;iOPN也可以明顯增強(qiáng)RIG-Ⅰ、MDA5、TRIF以及STING&cGAS等接頭分子所介導(dǎo)的IFNβ啟動(dòng)子區(qū)的活化。
　　2.OPN缺

10、陷型小鼠相比較于野生型小鼠，會(huì)產(chǎn)生較少的IFNβ，進(jìn)而造成此組巨噬細(xì)胞或成年小鼠在經(jīng)VSV病毒感染后，VSV病毒的滴度以及VSV mRNA水平以及VSV病毒的蛋白表達(dá)程度更高。并且OPN缺陷型小鼠組在大劑量VSV病毒感染后，生存率明顯低于野生型小鼠組。
　　3.前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明OPN，尤其是iOPN的確可以正調(diào)IFNβ的產(chǎn)生，又由于IRF3是重要的調(diào)控IFNβ表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，我們進(jìn)而研究IRF3的活化水平是否有變化。我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是

11、在啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合、磷酸化、二聚化以及入核等方面，iOPN都可以起到正調(diào)作用，說(shuō)明iOPN的確是通過(guò)影響IRF3轉(zhuǎn)錄因子的活化進(jìn)而增強(qiáng)了IFNβ的表達(dá)。
　　4.為了明確iOPN作用的靶點(diǎn)，我們經(jīng)報(bào)告基因以及realtime-PCR等技術(shù)發(fā)現(xiàn)iOPN作用的靶點(diǎn)可能存在于MAVS以及TBK1附近。通過(guò)免疫共沉淀我們發(fā)現(xiàn)iOPN可以特異性與TRAF3結(jié)合，并且這一結(jié)論也經(jīng)免疫熒光以及體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　5.在知道作用靶點(diǎn)為T

12、RAF3后，我們進(jìn)一步研究可能的機(jī)制。泛素化調(diào)節(jié)作用在機(jī)體中具有舉足輕重的作用，我們首先研究下iOPN是否會(huì)影響TRAF3的泛素化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iOPN可以抑制TRAF3發(fā)生K48位泛素化修飾，即iOPN可以起到穩(wěn)定TRAF3表達(dá)的作用。無(wú)論是在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)iOPN，或是在OPN缺陷型的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，iOPN的過(guò)表達(dá)或缺失都會(huì)導(dǎo)致放線菌酮(CHX)介導(dǎo)的TRAF3的穩(wěn)定性發(fā)生明顯變化。
　　6.由于我們發(fā)現(xiàn)iOPN可

13、以抑制TRAF3發(fā)生K48位泛素化修飾，但由于iOPN本身并沒有去泛素化酶功能，這就提示我們可能iOPN可以抑制某種可介導(dǎo)TRAF3的K48位泛素化作用的E3連接酶與其結(jié)合，或者募集某種可以去除TRAF3的K48位泛素化鏈的去泛素化酶與TRAF3結(jié)合，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)之前有報(bào)道過(guò)的TRAF3的去泛素化酶USP25并沒有因?yàn)閕OPN的加入而更加明顯的除去TRAF3上的泛素化鏈，而Triad3A對(duì)于TRAF3的K48位泛素化修飾作用則由于iOP

14、N的加入而明顯受到抑制。進(jìn)而我們發(fā)現(xiàn)iOPN可以明顯的抑制TRAF3與Triad3A的結(jié)合，并且TRAF3的Y440、Q442位點(diǎn)如若被突變則TRAF3不與Triad3A結(jié)合，同時(shí)也不與iOPN結(jié)合。綜上說(shuō)明iOPN可能是通過(guò)結(jié)合了TRAF3進(jìn)而抑制了Triad3A與TRAF3的結(jié)合，iOPN與Triad3A肯能是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合關(guān)系。
　　7.通過(guò)構(gòu)建的iOPN-WT以及iOPN-N端或iOPN-C端截短體，我們發(fā)現(xiàn)iOPN的C端可以與

15、TRAF3發(fā)生結(jié)合，并且通過(guò)在OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中進(jìn)行iOPN回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步確定iOPN的C端即足以發(fā)揮結(jié)合TRAF3、抑制TRAF3的K48位泛素化以及增強(qiáng)IFNβ產(chǎn)生的作用。
　　結(jié)論:
　　1.OPN的表達(dá)可被病毒所誘導(dǎo)，并且OPN尤其是iOPN可以正調(diào)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　2.OPN在體內(nèi)也是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的強(qiáng)力正調(diào)者，可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗病毒免疫應(yīng)答。
　　3.iOPN可以正調(diào)IRF3轉(zhuǎn)錄

16、因子的活化。
　　4.iOPN可以與重要接頭分子TRAF3特異性結(jié)合。
　　5.IOPN可以調(diào)節(jié)TRAF3的K48位偶聯(lián)的泛素化修飾并且使TRAF3更穩(wěn)定。
　　6.iOPN與Triad3A競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TRAF3,進(jìn)而影響Triad3A介導(dǎo)的，TRAF3的K48位偶聯(lián)的泛素化。
　　7.iOPN通過(guò)C端與TRAF3結(jié)合，并且其C端即可影響TRAF3的泛素化即穩(wěn)定性。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
　　1.本研究首

17、次明確完善地證明iOPN可以參與調(diào)控抗病毒天然免疫反應(yīng)，可以正向調(diào)節(jié)IFNβ的產(chǎn)生以及具有明顯的抗病毒功能。這一功能的機(jī)制是由于iOPN通過(guò)抑制Triad3A與TRAF3的結(jié)合，從而抑制了Triad3A對(duì)TRAF3的K48位泛素化修飾作用，進(jìn)而導(dǎo)致TRAF3的穩(wěn)定性增強(qiáng)，IFNβ的活化進(jìn)而增強(qiáng)。
　　2.本研究提出iOPN可以抑制某分子的泛素化作用這一機(jī)制在國(guó)際上尚屬少見，極大豐富了我們對(duì)于OPN功能的理解。并且我們首次發(fā)現(xiàn)iOP