HBV核心蛋白突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其拮抗IFN-_抗病毒機制的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建HBV核心蛋白(HBc)突變體L60V,I97L,S85G重組質(zhì)粒(pEGFP-L60V,pEGFP-I97L,pEGFP-S85G),以探討HBV核心蛋白(HBc)拮抗α干擾素(IFN-α)抗病毒活性及其相關(guān)機制。
　　方法：以質(zhì)粒p3.8Ⅱ為模板PCR法擴增HBc基因,與真核細胞表達載體pEGFP-N1連接構(gòu)建pEGFP-HBc-WT,通過定點突變技術(shù)構(gòu)建HBc突變體融合表達載體pEGFP-L60V,pEGFP-I9

2、7L,pEGFP-S85G;應(yīng)用熒光顯微鏡及 Western blot技術(shù)進行質(zhì)粒鑒定。
　　將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染人肝胚瘤細胞株 HepG2細胞,運用熒光顯微鏡及Western blot法分析其在細胞中的表達及細胞亞定位;以RT-PCR及Western blot法檢測JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)分子(STAT1、STAT2、IRF9、SOCS3)及抗病毒蛋白(MxA、PKR、2',5'-OAS)的表達,并以We

3、stern blot技術(shù)分析HepG2細胞內(nèi)NF-κB p65亞基的表達。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切和測序分析,成功構(gòu)建HBc突變體L60V,I97L,S85G重組質(zhì)粒;將這三種突變體表達質(zhì)粒(pEGFP-L60V,pEGFP-I97L,pEGFP-S85G)分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,以1,000IU/mL IFN-α處理,細胞內(nèi)抗病毒蛋白MxA及JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑分子STAT1、STAT2、IRF9等呈低表達,其中轉(zhuǎn)染pEGF

4、P-I97L的HepG2細胞抗病毒蛋白及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)分子變化最為顯著,SOCS3呈高表達;pEGFP-L60V,pEGFP-I97L,pEGFP-S85G轉(zhuǎn)染 HepG2細胞并經(jīng) IFN-α處理后,NF-κB p65蛋白表達顯著降低。
　　結(jié)論：HBc及其突變體(L60V,I97L,S85G等)很可能通過影響JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)分子和抗病毒蛋白的表達從而拮抗 IFN-α的抗病毒效應(yīng);NF-κB及SOCS3可能參與HBc