毒力島基因ibet缺失的e.colik1的構建及其對hbmec侵襲力的研究

1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文毒力島基因ibeT缺失的E.coliK1的構建及其對HBMEC侵襲力的研究姓名：方文剛申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：王桂珍20090401方 法1 、查找基因組文庫，使用P r i m e r 5 軟件設計引物，用P C R 方法擴增出i b e T基因上游片段( A ) 和下游片段( B ) 。2 、運用基因重組方法，以毒力島基因i b e T 上游片段( A ) 和下游片段( B )的部分序列作

2、為同源序列的兩側序列。3 、以p C V D 4 4 2 作為載體，構建含有相互連接的上游片段( A ) 和下游片段( B )的重組自殺質粒p C V D 4 4 2 A B ．4 、以野生型大腸桿菌E 4 4 為研究對象，通過接合轉移和同源重組，利用氨卞抗性和利福平抗性篩選，構建缺失毒力島基因i b e T 的基因缺失株大腸桿菌。5 、以不同濃度兩株大腸桿菌與H B M E C 共培養(yǎng)，計數(shù)野生型大腸桿菌和基因缺失株大腸桿菌侵入H B

3、 M E C 的個數(shù)。6 、用羅丹明標記的毒傘素染細胞骨架，用D A P I 染細胞核，熒光顯微鏡觀察細胞骨架的變化，同時觀察兩個菌株侵入H B M E C 的個數(shù)。結 果1 、通過P C R 擴增和測序分析，大腸桿菌E 4 4 的毒力島基因i b e T 缺失。2 、兩株細菌都能侵入到H B M E C 內部。 i b e T 缺失株E 4 4 與野生型E 4 4 相比，侵入到H B M E C 內部的個數(shù)明顯下降，經(jīng)過統(tǒng)計學分析，有