淋球菌多重耐藥基因mtr系統(tǒng)和毒力島基因的作用及EGS干預(yù)研究.pdf

1、第一部分:淋球菌多重耐藥性與mtrR基因點突變的關(guān)系 目的:探討多傳遞耐藥(multipletransferableresistance，mtr)外排系統(tǒng)中mtrR基因點突變與淋球菌流行株多重耐藥性的關(guān)系。 結(jié)論:淋球菌mtrR基因第45位gly(GGC→GAC)asp、14位his(CAC→CGC)arg和第51位phe(TTC→GTC)val突變與淋球菌流行株的多重耐藥性密切相關(guān)。 第二部分:淋球菌主動外排泵

2、mtrC基因原核表達系統(tǒng)pET-mtrC的構(gòu)建、鑒定和表達 目的:在原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)中構(gòu)建淋球菌膜蛋白mtrC表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌DE3中表達相關(guān)目的蛋白，為淋球菌耐藥的檢測和耐藥機制的研究提供基礎(chǔ)。 結(jié)論:淋球菌膜蛋白mtrC原核表達質(zhì)粒構(gòu)建和表達成功，為研究其mtr外排系統(tǒng)的耐藥機制打下基礎(chǔ)。 第三部分:淋球菌MtrC融合蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株建立和特性鑒定 目的:建立針對淋球菌

3、MtrC膜蛋白的單克隆雜交瘤細胞株，制備相應(yīng)的單克隆抗體，用于淋球菌耐藥機制的研究和淋球菌耐藥的臨床檢測。 結(jié)論:本研究建立的單抗在檢測淋球菌MtrC膜蛋白時有高度特異性和敏感性。 第四部分:抗MtrC單克隆抗體對淋球菌CIP耐藥水平的影響 目的:探討用抗MtrC單克隆抗體(MtrCmonoclonalantibody，MtrCAb)干預(yù)淋球菌多傳遞耐藥(multipletransferableresistan

4、ce，mtr)系統(tǒng)后，mtr主動外排泵與同環(huán)丙沙星(CIP)耐藥的關(guān)系。 結(jié)論:淋球菌外排泵主動泵出CIP，導(dǎo)致菌體內(nèi)CIP積累量不足，這是引起淋球菌對CIP高水平耐藥的重要因素；MtrCAb、NaN3可以阻斷外排泵蛋白泵出CIP，恢復(fù)淋球菌對CIP的敏感性。 第五部分:外源指導(dǎo)序列逆轉(zhuǎn)淋球菌多重耐藥性研究 目的:研究外源指導(dǎo)序列(externalguidesequence，EGS)在體外逆轉(zhuǎn)淋球菌臨床分離多重耐

5、藥株為敏感株中的作用與能力。 結(jié)論:PET-28a(+)-EGS-MtrC轉(zhuǎn)化淋球菌成功；導(dǎo)入EGS-MtrC的轉(zhuǎn)化菌部分恢復(fù)了對氨芐西林的敏感性；轉(zhuǎn)化菌對阿奇霉素、結(jié)晶紫、紅霉素、TritonX-100、四環(huán)素的敏感性增加。 第六部分:Mtr系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析 目的:采用生物信息學(xué)的方法對多傳遞耐藥(mtr)外排系統(tǒng)中MtrR、MtrC、MtrD、MtrE蛋白的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)疏水性、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)的三維

6、結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)功能進行分析。 結(jié)論:應(yīng)用生物信息學(xué)的工具可以快速對淋球菌的目的基因進行分析，獲得其功能蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)數(shù)據(jù)，對蛋白質(zhì)疏水性、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的功能進行有效的預(yù)測，對研究淋球菌的耐藥系統(tǒng)及找到有效的干預(yù)措施有著重要的指導(dǎo)意義。 第七部分:淋球菌毒力島的生物信息學(xué)分析 目的:采用生物信息學(xué)的方法對淋球菌毒力島(pathogenicityisland)中TraH、TraG、AtlA的

7、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)疏水性、跨膜區(qū)和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行分析。對淋球菌基因組和GGI島的堿基組成進行比較分析和整合位點分析。 結(jié)論:應(yīng)用生物信息學(xué)的工具可以快速對淋球菌的目的基因進行分析，獲得其功能蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)數(shù)據(jù)，對蛋白質(zhì)疏水性、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行有效的預(yù)測和進行比較基因組學(xué)研究，對研究淋球菌的毒力島及找到有效的干預(yù)措施有著重要的指導(dǎo)意義。 第八部分:封閉TraH基因的外源指導(dǎo)序列對淋球菌Ⅳ型分泌

8、系統(tǒng)功能的影響 目的:研究外源指導(dǎo)序列(externalguidesequence，EGS)在體外封閉traH基因?qū)α芮蚓粜头置谙到y(tǒng)(typeⅣsecretionsystem，T4SS)功能的影響。 結(jié)論:GGI島存在于淋球菌MS11株中，淋球菌29400、FA1090株中不含GGI島；PET-28a(+)-EGS-traH轉(zhuǎn)化淋球菌成功；導(dǎo)入EGS-traH的轉(zhuǎn)化菌t-MS11株生存能力下降，Ⅳ型分泌系統(tǒng)的分泌DNA