多重耐藥腸球菌耐藥基因篩選及傳播機制研究.pdf

1、腸球菌作為一種條件致病菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一,是引起心內(nèi)膜炎、菌血癥和尿路感染的重要致病菌.臨床上常采用細菌細胞壁活性抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合來治療腸球菌感染,但當腸球菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶后會對高濃度氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥性,而在耐藥菌株中慶大霉素高水平耐藥 (high-levelgentamicin resistance.HLGR) 占了較大的比例,從而失去與細菌細胞壁活性抗菌藥物的協(xié)同作用,加大了治療的難度.特別是近年

2、出現(xiàn)的萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin resistant enterococcus,VRE) 給臨床治療造成困難,引起廣泛重視.HLGR的出現(xiàn)系氨基糖苷類修飾酶所致,修飾酶的產(chǎn)生可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失,并可致多重耐藥.慶大霉素耐藥主要是由腸球菌中的耐藥基因aac(6')-Ie-aph(2")-Ia編碼一種修飾酶AAC(6')-Ie-APH(2")-Ia引起.該修飾酶可介導對除鏈霉素以外的幾乎所有臨床使用的

3、氨基糖苷類抗生素的抗性,并可使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協(xié)同作用消失.另外還有新出現(xiàn)由aph(2")-Ic、aph(2")-Id及aph(2")-Ib基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(2")-Ic、APH(2")-Id和APH(2")-Ib.APH(2")-Ic使腸球菌對慶大霉素呈中等水平耐藥,并破壞慶大霉素的協(xié)同作用.APH(2")-Id和APH(2")-Ib可導致對鏈霉素以外氨基糖苷類的高水平耐藥,但并不消除阿米卡星與細胞壁活性藥物的協(xié)

4、同作用.已有報道,腸球菌的慶大霉素高水平耐藥基因aac(6')-Ie-aph(2")-Ia及aph(2")-Ic基因等大多位于可接合的較大的質(zhì)粒上,也有位于接合轉(zhuǎn)座子上或不可轉(zhuǎn)移的染色體上,有些轉(zhuǎn)座子還可插入質(zhì)粒中和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移.因此,上述耐藥基因的檢測有助于預測氨基糖苷類抗生素與細胞壁活性藥物合用的療效,而耐藥傳播機制的研究將有助于對耐藥性播散的控制.腸球菌對萬古霉素的耐藥可分為低水平耐藥(MIC 8-32μg/ml)和

5、高水平耐藥(MIC≥64μg/ml).根據(jù)腸球菌對萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥的誘導性,VRE分為6個表型,分別是VanA、VanB、VanC(C1、C2、C3)、VanD、VanE、VanG.其中以VanA和VanB型最為多見.萬古霉素與腸球菌細胞壁上的五肽肽糖前體的羧基末端D-丙氨酸-D-丙氨酸結(jié)合形成復合體,阻止肽糖聚合所需的轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)肽反應,從而抑制腸球菌的細胞壁生物合成.而在萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)的細胞壁肽糖前

6、體末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸發(fā)生了改變,萬古霉素不能與之相結(jié)合,因此不能抑制VRE的細胞壁合成.VanA耐藥常常與Tn1546樣元件同時存在.VanA型基因在不同的菌株間是高度保守的,但在Tn1546的整體結(jié)構(gòu)上,已發(fā)現(xiàn)有大量變異.許多變異歸因于轉(zhuǎn)座子內(nèi)不同插入序列(IS)元件的插入以及它們所引起的序列刪除.Tn1546因存在于接合性質(zhì)粒上而得到廣泛播散. 腸球菌是臨床較常見的一類細菌.近年來抗菌藥物的廣泛應用以及各種侵入性

7、醫(yī)用裝置的使用,使得腸球菌所致的醫(yī)院感染逐漸增多.由于腸球菌對抗生素的耐藥性增加,尤其是HLGR及VRE的分離率在國內(nèi)迅速上升,給臨床治療造成了更大的難題.本研究分析了臨床分離到的HLGR、VRE菌株的克隆相關性、耐藥性、耐藥基因及耐藥傳播機制,為HLGR、VRE感染的防治提供基礎.深入了解腸球菌的耐藥機制及耐藥性的傳遞特性,對于指導臨床合理使用抗菌藥物和防止耐藥株的流行有著重要的意義. 1.腸球菌耐藥性研究 收集200

8、2年6月～2003年5月我院臨床分離的腸球菌106株.其中分離自腹腔引流液的最多,占26.4﹪(28/106);其次分離自膽汁,占20.8﹪(22/106);尿來源的居第三位,占18.9﹪(20/106);血液來源居第四位,占17.0﹪(18/106).提示腸球菌所致的感染中,以腹腔感染最常見,其次為膽道感染、泌尿系統(tǒng)感染及菌敗血癥.在所分離的腸球菌中,糞腸球菌和屎腸球菌的分離率最高,分別為45.3﹪(48/106)和43.4﹪(46/

9、106),共占總數(shù)的88.7﹪.采用K-B法及瓊脂稀釋法測定106株腸球菌對13種抗菌藥物的耐藥性,發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧沒有耐藥株;屎腸球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌;奎奴普丁/達福普汀對糞腸球菌的作用差,而對屎腸球菌有較強作用.所有腸球菌經(jīng)頭孢硝噻吩紙片法檢測,未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陽性株,推測本院腸球菌對β一內(nèi)酰胺類抗生素耐藥主要是由于低親和力的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的過量產(chǎn)生.采用瓊脂篩

10、選法篩選出氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌(HLAR)78株,占73.6﹪,其中HLGR占64.29/0(68/106),HI,SR占45.3﹪(48/106). 2.慶大霉素高水平耐藥腸球菌耐藥基因及同源性研究 PCR檢測出68株HLGR中63株aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因陽性,占92.6﹪;3株存在與aph(2")-Id高同源性的基因.50株住院病人分離的HLGR中,屎腸球菌的PFGE圖譜有8型(A-H

11、),以A型為主;糞腸球菌的PFGE圖譜有4型(A-D),呈多克隆散發(fā).提示HLGR己成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌,主要通過aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因編碼的修飾酶造成對慶大霉素高度耐藥. 3.新氨基糖苷類抗生素耐藥基因及傳播機制研究 鉛黃腸球菌H295為瓊脂稀釋法篩選所得的慶大霉素高水平耐藥菌株 (HLGR),于2002年7月由我院一位ICU住院病人腹腔引流液中分離得到的.本研究通過原始耐藥菌UZ95質(zhì)粒抽

12、提并酶切克隆測序及Southern雜交發(fā)現(xiàn)了與aph(2")-Id基因高度同源(核苷酸同源性為96.1﹪,氨基酸同源性為93.7﹪)的慶大霉素高水平耐藥新編碼基因aph(2")-Ie基因(GenBank登錄號AY 677166)位于一約16kb大小的質(zhì)粒上.在aph(2")-Ie基因的下游發(fā)現(xiàn)存在另一耐藥基因鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶str基因,屬于aad基因家族.該基因?qū)е聦︽溍顾丶按笥^霉素的耐藥,與腸球菌中3'-鏈霉素腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadE)基

13、因同源性較高,在乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌等中有報道,但在腸球菌中卻未見報道.質(zhì)粒復制起始蛋白repD存在于兩個耐藥基因之間.耐藥基因可以通過整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列及某些未知的轉(zhuǎn)移機制在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移或集聚重排.本研究發(fā)現(xiàn)在aph(2")-Ie基因讀碼框的上游存在與IsEcpl高度相似的插入序列,含有轉(zhuǎn)座酶TnpA.該酶能夠特異識別和接合轉(zhuǎn)座子與靶點序列,可和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移或誘動質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移.提示HLGR也可由一種新的質(zhì)粒介導的

14、APH(2")-Ie氨基糖苷類修飾酶所引起.aph(2")-Ie通過轉(zhuǎn)座酶與其他耐藥基因一起由質(zhì)粒傳播. 4.萬古霉素耐藥腸球菌耐藥基因及傳播機制研究 2006年5月～2007年4月在杭州市四家醫(yī)院收集到臨床分離的萬古霉素耐藥腸球菌16株耐藥表型均符合VanA型,基因型證實均為VanA型.多對引物對轉(zhuǎn)座子的不同區(qū)域的PCR擴增并進行序列拼接、比對,發(fā)現(xiàn)VRE ZY21237的VanA基因位于轉(zhuǎn)座子Tn1546上,其它1

15、5株VRE菌株的 VanA 基因周圍序列與Tn1546相似,是一種未報道的Tn1546類似轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu).其中新的編碼轉(zhuǎn)座酶的插入序列(IS1485)可增強轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座功能.臨床分離的16株VRE菌株vanA基因均可通過濾膜接合進行轉(zhuǎn)移.VRE菌株均由VanA基因所引起,可通過轉(zhuǎn)座子Tn1546與Tn1546類似轉(zhuǎn)座子在不同菌株或菌種之間進行傳播.杭州市四家醫(yī)院分離的16株VRE菌株屬于7個不同型,并非單克隆播散,其中14株屬于適應醫(yī)院環(huán)境

16、的克隆復合體(Clonal Complex17.CC17). 以上研究表明: 1. HLGR已成為醫(yī)院感染的重要耐藥菌,主要通過aac(6')-Ie-aph(2")-Ia基因編碼的修飾酶造成對慶大霉素高度耐藥. 2. 住院病人分離的HLGR脈沖凝膠電泳分析,屎腸球菌HLGR主要為單克隆播散;糞腸球菌HLGR則呈多克隆散發(fā). 3. 新的慶大霉素高水平耐藥編碼基因aph(2")-Ie基因(GenBank登錄號