腸球菌耐藥性及其分子機制研究.pdf

1、目的：
　　通過對萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycini resistance Enterococcus,VRE)耐藥機制、分子流行病學及vanA耐藥基因所處轉(zhuǎn)座子Tn1546分子結(jié)構(gòu)的研究，了解我院VRE菌株流行特點，為臨床抗感染治療及有效控制VRE院內(nèi)傳播提供依據(jù)。
　　研究認為母雞腸球菌天然含有vanC1基因簇，通過組成型表達和誘導型表達對萬古霉素呈現(xiàn)低水平耐藥，但實驗室分離出10株對萬古霉素呈現(xiàn)敏感表型的母雞腸球

2、菌，通過體外萬古霉素耐藥誘導試驗檢測試驗菌株對萬古霉素耐藥是否為誘導型表達，同時檢測試驗菌株中vanC1基因簇中各基因及各基因表達情況，在分子水平探討母雞腸球菌對萬古霉素呈現(xiàn)敏感的原因，為臨床抗感染治療提供新思路。
　　自一門診病人血標本中分離出1株vanC1基因陽性且對萬古霉素呈現(xiàn)敏感的屎腸球菌，而目前尚無從人類分離出vanC1基因陽性屎腸球菌的報道。通過檢測此菌株vanC1基因簇中各基因及其表達情況、采用脈沖場凝膠電泳（Pul

3、sed field gel electrophoresis，PFGE）及Southern雜交的方法檢測屎腸球菌中vanC1基因定位，同時采用多位點序列分型對此菌株進行分型研究，以對試驗菌株有更為詳盡的認識。
　　方法：
　　1.2010年1月至2012年5月同濟醫(yī)院臨床微生物室共分離678株腸球菌，以萬古霉素最小抑菌濃度（E-test）大于等于32μg/ml為篩選標準，共篩選出22株VRE（排除同一患者同一部位重復分離的菌株

4、），包括21株屎腸球菌，1株母雞腸球菌。采用瓊脂稀釋法對22株萬古霉素耐藥腸球菌進行抗菌藥物敏感性實驗；根據(jù)藥敏實驗結(jié)果確定萬古霉素耐藥表型；PCR檢測萬古霉素耐藥基因；對vanA基因陽性菌株檢測Tn1546分子結(jié)構(gòu)；多位點序列分型（multilocus sequence typing,MLST）分析萬古霉素耐藥屎腸球菌分子流行病學。
　　2.對2009至2011年自患者無菌體液中分離出的10株母雞腸球菌，紙片擴散法檢測萬古霉素藥

5、物敏感性為敏感，對此10株菌進行研究。采用萬古霉素耐藥腸球菌篩選實驗鑒別萬古霉素耐藥母雞腸球菌（vancomycin resistance E.gallinarum,VREg）和萬古霉素敏感型母雞腸球菌(vancomycin susceptible E.gallinarum,VSEg)；瓊脂稀釋法檢測試驗菌株對常用抗菌藥物敏感性；萬古霉素耐藥誘導試驗檢測母雞腸球菌可否為萬古霉素誘導耐藥；PCR方法檢測試驗菌株vanC1、vanXYc、v

6、anTc及啟動子區(qū)域基因；RT-PCR方法檢測基因表達。
　　3.TJ4031分離自2012年一門診患者血標本。PCR方法檢測試驗菌株vanC1、vanXYc及vanTc基因，RT-PCR分析基因表達情況，采用PFGE及Southern雜交的方法對vanC1基因定位進行研究，同時采用MLST分析此株菌型別。
　　結(jié)果：
　　一、萬古霉素耐藥腸球菌耐藥性及其流行病學
　　1、22株VRE對氟喹諾酮類、氨基糖苷類、青

7、霉素類等抗菌藥物均呈100％耐藥，未檢出利奈唑胺耐藥菌，21株屎腸球菌萬古霉素耐藥特征為vanA表型-vanA基因型，母雞腸球菌耐藥特征為vanA表型-vanA和vanC1基因共存型；
　　2、22株VRE中所攜帶轉(zhuǎn)座子Tn1546結(jié)構(gòu)分為Ⅰ（8株）、Ⅱ（12株）、Ⅲ（1株）及Ⅳ型（1株）；21株屎腸球菌有三種MLST型別，其中19株菌為ST17型，另2株菌分別屬于ST78和ST64型。
　　二、萬古霉素敏感母雞腸球菌分子機

8、制研究
　　1、10株母雞腸球菌通過萬古霉素耐藥篩選試驗顯示4株為萬古霉素耐藥母雞腸球菌（VREg），6株為萬古霉素敏感母雞腸球菌（VSEg）；
　　2、瓊脂稀釋法藥敏結(jié)果顯示VREg菌株對青霉素、氨芐西林及氟喹諾酮類藥物敏感率均高于VSEg菌株；萬古霉素耐藥誘導試驗顯示6株VSEg菌株不能被誘導耐藥；
　　3、PCR檢測vanC1、vanXYc、vanTc及啟動子基因顯示10株母雞腸球菌vanC1和vanXYc基因均

9、為陽性，4株VREg菌株vanTc和啟動子基因陽性，6株VSEg菌株vanTc和啟動子基因陰性；
　　4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示，6株VSEg菌株vanC1、vanXYc基因均未表達。
　　三、vanC1基因陽性屎腸球菌分子機制研究
　　TJ4031菌株vanC1基因簇中vanC1及vanXYc基因為陽性，但RT-PCR分析結(jié)果表明兩基因并未表達，MLST檢測此株菌為新的ST序列型即ST837型，Southern雜交

10、分析結(jié)果顯示此vanC1基因定位于染色體。
　　結(jié)論：
　　一、萬古霉素耐藥腸球菌耐藥性及其流行病學
　　1、VRE菌株對常見抗菌藥物幾乎均呈現(xiàn)耐藥，可以用來選擇治療的抗生素非常有限，VRE菌株的傳播也使抗感染治療成為一個棘手的問題，因此一旦出現(xiàn)泛耐藥的細菌臨床微生物室、臨床科室及醫(yī)院感染控制部門應充分協(xié)作，采取有效措施控制耐藥菌株的傳播。
　　2、研究顯示我院VRE的流行主要由vanA耐藥基因引起，轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)T

11、n1546存在變異，3種MLST型別均屬于CC17克隆型，為院內(nèi)感染主要流行株，臨床應加強抗菌藥物的合理使用以預防耐藥菌株的傳播。
　　3、本研究檢出一株高水平萬古霉素耐藥母雞腸球菌，此菌同時含有vanA和vanC1基因，目前國內(nèi)尚無高水平耐藥母雞腸球菌的報道，應將母雞腸球菌列入常規(guī)檢測之中，以更好監(jiān)測萬古霉素耐藥腸球菌的流行狀況。
　　二、萬古霉素敏感母雞腸球菌分子機制研究
　　1、研究結(jié)果表明試驗菌株中4株VREg

12、可誘導對萬古霉素耐藥，而6株VSEg則不可誘導耐藥，表明6株VSEg對萬古霉素不表達耐藥，vanC1基因的在其菌體內(nèi)并未產(chǎn)生預期的對萬古霉素耐藥的作用，提示對于此類菌株所致臨床感染可嘗試選擇萬古霉素進行治療，但仍需進一步研究；
　　2、本部分中VREg對常用抗生素敏感率高于VSEg，表明VREg所引起感染治療藥物選擇范圍可能比VSEg菌株更為寬廣，但對于微生物所致感染的治療仍需以臨床微生物室藥敏試驗結(jié)果為基礎來合理選擇抗生素方能有

13、效快速治療；
　　3、對試驗菌株進行分子研究發(fā)現(xiàn)，與VREg不同，VSEg菌株中存在vanTc及啟動子基因的缺失，推測其出現(xiàn)的原因可能為長期進化過程致vanC1基因簇轉(zhuǎn)移，而基因整合至新的菌株時基因簇中部分基因如vanTc基因出現(xiàn)整合失敗而丟失，進而出現(xiàn)在糞腸球菌中檢出不完整vanC1基因簇的報道。
　　三、vanC1基因陽性屎腸球菌分子機制研究
　　此株vanC1陽性屎腸球菌，Southern雜交結(jié)果顯示vanC1基