淋病流行特征及淋球菌耐藥性研究.pdf

1、第一部分：淋病患者流行病學特征分析及淋球菌分離株的耐藥性監(jiān)測 一、探討目前淋病流行特征及病人就醫(yī)行為的特點。在上海地區(qū)選擇3所性病?？漆t(yī)院或門診，對門診病例中確診為淋病者進行流行病學問卷調查。結果顯示，淋病門診病例中以男性居多(87．5％)，年齡分布以20歲～、30歲～、40歲～三組為主(93．8％)，職業(yè)分布居前三位者為工人、民工、干部，占全部病例的65．1％，傳播途徑以非婚性接觸為主要傳播方式(76．3％)；對性行為及疾病情

2、況分析發(fā)現(xiàn)堅持使用安全套者占18．7％，出現(xiàn)淋病癥狀后仍有性生活者占28．8％；對就醫(yī)行為分析表明，出現(xiàn)淋病臨床相關癥狀后3天內就診者占32．5％，有17．5％的病例愿意選擇私人診所或者不正規(guī)治療，同時發(fā)現(xiàn)20．1％的病人兩周內曾有抗生素使用史。從調查結果可以看出，淋病在上海地區(qū)仍然主要是以非婚性接觸為主要傳播途徑；調查對象的性行為及疾病求醫(yī)行為需要引導和促進，在出現(xiàn)淋病相關癥狀后仍有無保護的性行為發(fā)生，以及一些病人曾有使用抗生素史，存

3、在著傳播淋病的潛在危險，也容易促進行耐藥菌株的產(chǎn)生及流行。 二、為了解淋球菌臨床分離株對抗生素的耐藥性，我們采用瓊脂平皿稀釋法測定青霉素、頭孢曲松、四環(huán)素、多西環(huán)素、氧氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、阿奇霉素和壯觀霉素對淋球菌的最低抑菌濃度(MIC)，用紙片酸度法對菌株作β一內酰胺酶測定。并根據(jù)檢測的耐藥性結果對菌株和抗生素進行了聚類分析。結果表明，所檢測的80株菌株中，所有菌株均對頭孢曲松和壯觀霉素敏感：其中87．5％對青霉素耐藥

4、，88．7％對四環(huán)素耐藥，產(chǎn)青霉素酶的淋球菌(PPNG)和高水平耐四環(huán)素的淋球菌(TRNG)分別占45％和18．8％；對阿奇霉素的耐藥率為94．7％；對氧氟沙星、洛美沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為97．5％，95．0％和95．O％。依據(jù)耐藥性監(jiān)測的結果分別進行Q聚類和R聚類，可進一步將菌株分成四類，將抗生素分成三類，為研究耐藥性與基因分型的聯(lián)系打下基礎，由耐藥性監(jiān)測結果可以看出，淋球菌臨床分離株的耐藥性非常嚴重，對淋球菌的耐藥性進行連續(xù)性

5、監(jiān)測是淋病預防控制中必不可少的步驟。 第二部分淋球菌基因分型及淋球菌耐藥性關系的研究 一、建立并優(yōu)化隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技術對淋球菌進行基因分型的方法，探索運用RAPD進行傳染源追蹤的可行性。采用四種不同的預處理方法提取淋球菌基因組DNA，按照擴增結果進行優(yōu)劣比較：運用RAPD對淋球菌標準菌株進行區(qū)分及對經(jīng)性伴傳播的淋病病例進行RAPD指紋圖譜比較。結果表明運用十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法可以抽提較完整

6、的基因組DNA，獲得良好的RAPD指紋圖譜；各菌株的RAPD指紋圖譜間有明顯DNA多態(tài)性；臨床經(jīng)性伴傳播的病例中獲得了相似的RAPD指紋。研究表明，如果選擇最佳的DNA抽提技術、合適的隨機引物，運用RAPD指紋圖譜可以對淋球菌進行有效基因分型，并可作為分子流行病學對傳染源的追蹤的一種輔助手段。 二、了解上海地區(qū)淋病病原體奈瑟氏雙球菌的不同基因分型及各基因型與耐藥性之間的對應關系。我們在建立了RAPD基因分型的基礎上，運用RAPD

7、技術對80株淋球菌臨床分離株進行了區(qū)分，從分子水平對淋球菌進行基因分型，并在此基礎上結合淋球菌耐藥性監(jiān)測結果探討不同的基因分型與耐藥性之間的關系。結果顯示80株淋球菌分離株有著較為相似的RAPD指紋圖譜，但各菌株的指紋圖譜之間有一定的多態(tài)性，依據(jù)指紋圖譜的多態(tài)性可將菌株區(qū)分為I、II、III三種基因分型，對此三種基因分型與A、B、C、D四種不同的耐藥類型進行對應分析，發(fā)現(xiàn)耐藥類型與基因型別之間存在對應關系。通過本研究發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)淋球菌流

8、行株有著不同的耐藥特點及基因型別，耐藥性與不同的基因分型之間存在著一定相關性(×2=27．59，P

9、b和4．2kb質粒檢出率較高，分別為75．O％和96．3％。質粒譜型有10種，其中以42．5kb+39．5kb+7．4kb+4．2kb、39．5kb+7．4kb+4．2kb、7．4kb+4．2kb及4．2kb四種類型居多，占86．25％。所有檢測出的PPNG菌株(包括PPNG／TRNG)均含有7．4kb質粒，而所有TRNG菌株(包括PPNG/TRNG)則均含有42．5kb質粒和39．5kb質粒；而非PPNG或TRNG中所攜帶的質粒譜型則

10、相對復雜。從而初步認為，淋球菌臨床分離株所攜帶的4．2kb的質粒，在大部分菌株中可以檢出，其在淋球菌耐藥機制中的具體意義尚不清楚，而7．4kb的質?？赡軙閷Я芮蚓咚降那嗝顾啬退幮裕?2．5kb及39．5kb質?？赡芘c介導四環(huán)素高水平耐藥有關。 二、探討淋球菌的耐藥質粒與淋球菌耐藥性之間的關系。我們對淋球菌耐藥株所攜帶的耐藥質粒進行質粒消除實驗，同時以此消除的質粒轉化感受態(tài)的大腸桿菌，比較耐藥質粒消除和轉化前后菌株的耐藥性變

11、化。結果表明，在亞致死濃度的十二烷基磺酸鈉(SDS)作用下，淋球菌的耐藥質?？梢员徊糠窒?仍然攜帶42．5kb的質粒)或者完全消除，且消除子在消除前后對抗生素的耐藥性會發(fā)生改變：而耐藥質粒在不同的種屬的菌株之間可進行傳遞，可以將淋球菌的耐藥質粒傳遞給感受態(tài)的大腸桿菌，篩選出的轉化子分別攜帶含有tetM基因的42．5kb的四環(huán)素耐藥質粒和攜帶含有TEM一1基因的7．4kb的青霉素耐藥質粒，轉化子可產(chǎn)生對相應抗生素的耐藥性。 第四

12、部分淋球菌耐藥性與染色體耐藥基因的關系研究 一、探討淋球菌耐藥株gyrA與parc基因突變與淋球菌對喹諾酮類抗生素耐藥性之間的關系。結合前文瓊脂稀釋法測定淋球菌臨床分離株對行喹諾酮類抗生素敏感性的結果，運用PCR技術擴增gyrA基因和parc基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDRs)，并對典型菌株的PCR產(chǎn)物直接進行測序分析。產(chǎn)物測序結果顯示淋球菌敏感株只檢出gyrA基因Asp95單位點突變，中介菌株及耐藥菌株在gyrA基因均檢出有

13、Ser一91一Phe突變并伴有Asp95或者Ala92位突變，同時有6株檢出有parc基因的86、87、91位點突變及其它位置的無義突變。 進一步根據(jù)喹諾酮類耐藥決定區(qū)測序的結果，我們針對不同的突變類型采用不同的擴增引物，為所擴增PCR產(chǎn)物在突變易發(fā)生的位置引入新的酶切位點，并運用mnfI、SalI、PstI等限制性內切酶對80株淋球菌臨床分離株的相關PCR產(chǎn)物進行了多態(tài)性分析，綜合測序結果及RFLP分析結果可證明gyrA基因和

14、parc基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDRs)的突變與淋球菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性密切相關，其中gyrA基因突變是淋球菌耐喹諾酮類抗生素的重要機制，而Ser一91一Phe更是引起對喹諾酮類耐藥非常關鍵的突變，parc基因的突變可能會對淋球菌耐喹諾酮類抗生素起促進作用，常常伴隨gyrA基因突變同時出現(xiàn)，與gyrA基因突變共同介導淋球菌對喹諾酮類抗生素的高水平耐藥性。 二、探討mtr系統(tǒng)在介導淋球菌對阿奇霉素耐藥性中的作用，以及m

15、tr基因系統(tǒng)之間的負向調節(jié)關系。對臨床分離的淋球菌代表株mtrR基因序列及mtrR啟動子區(qū)域回文結構序列的突變進行了測序分析，并運用熒光定量PCR技術對受mtrR基因調控的結構基因mtrC的表達水平進行了研究；同時結合前文對淋球菌耐藥性監(jiān)測的結果來揭示mtr系統(tǒng)和淋球菌對阿奇霉素耐藥性的可能關系，結果表明所有中介菌株及耐藥菌株均發(fā)生mtrR基因m05Y的突變，并伴隨mtrR啟動子區(qū)域回文結構的缺失突變；而敏感株有一株出現(xiàn)G45D的突變，

16、但mtrR啟動子區(qū)域回文結構均未檢測出有突變。調控基因mtrR的突變影響了結構基因mtrC的表達，在有mtrR基因第105位密碼子突變，并伴隨mtrR啟動子區(qū)域回文結構缺失突變的菌株與無此兩位點突變菌株的mtrC基因表達有顯著差異(x‘：9．525，P

17、E有著負向調節(jié)作用，當mtrR基因及啟動子發(fā)生突變時，會導致結構基因的過度表達，進而形成淋球菌對抗生素的耐藥性。 三、研究淋球菌青霉素耐藥性與penA及ponA基因突變的關系。分別運用PCR—SSCP、PCR—RFLP對淋球菌penA及ponA基因進行了分析，在所檢測的80株淋球菌臨床分離株中，所有菌株的penA基因均發(fā)生了(Asp-345,~)的插八突變，改變了其表達產(chǎn)物青霉素結合蛋白2(PBP2)對青霉素的親合力，而表現(xiàn)出對

18、青霉素不同程度的耐藥性。PonA作為編碼青霉素結合蛋白1(PBPl)的基因，通過RFLP分析檢測出有近93．7％的菌株發(fā)生了第421位氨基酸由亮氨酸變成脯氨酸(Leu421一Pro)的突變，此突變影響了青霉素結合蛋白l與青霉素的親合力。同時研究還表明所有的PPNG菌株也可同時發(fā)生penA基因的突變，除兩例ponA未突變外，絕大多數(shù)PPNG可發(fā)生ponA基因的突變。結果顯示在淋球菌流行株中染色體介導和質粒介導兩種方式協(xié)同作用造成了淋球菌對