臨床分離菌株耐藥性及特征性耐藥酶表型分析.pdf

1、細菌感染疾病曾是危害生命最嚴重疾病之一，也是常見的造成臨床死亡原因之一。伴隨著青霉素的誕生及一系列抗生素應(yīng)用，細菌性傳染病得到了有效控制，其病死率大幅下降。然而，由于抗菌藥物濫用，病原菌普遍產(chǎn)生耐藥性，造成病人治療無效，甚至危機生命。為了克服耐藥，新的抗生素尤其廣譜抗生素廣泛應(yīng)用于臨床，在抗生素壓力選擇和誘導(dǎo)下，細菌又會產(chǎn)生新的耐藥基因，最后導(dǎo)致臨床出現(xiàn)不治性感染性疾病。由此可見，如何合理應(yīng)用抗生素、避免盲目濫用抗生素、減少病原菌耐藥株

2、產(chǎn)生，如何了解、預(yù)測病原菌耐藥株的出現(xiàn)，避免其耐藥性的傳播，是醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題之一。不同地區(qū)、不同醫(yī)院臨床病原菌耐藥性各有其特點，此與不同地區(qū)、不同醫(yī)院所選抗生素種類及用量不同而有所差別；也與不同地區(qū)、不同醫(yī)院耐藥菌所攜帶耐藥酶基因種類不同及耐藥菌水平傳播相關(guān)聯(lián)。因此掌握本地區(qū)細菌對抗生素耐藥特點，了解臨床感染病菌產(chǎn)生耐藥酶狀況，對本地區(qū)合理應(yīng)用抗生素，防止耐藥菌產(chǎn)生，預(yù)防難治性感染性疾病出現(xiàn)，挽救病人生命具有十分重要意義。

3、 目前，感染性疾病的治療除了應(yīng)用抗生素外，中草藥對感染性疾病作用效果日益受到重視，中草藥由于毒副作用小，費用低，在細菌普遍產(chǎn)生耐藥性的今天倍受關(guān)注。然而，目前中藥的抗菌譜及作用機理不甚明了，對于各種病原菌耐藥狀況有待于探索，病原菌對中草藥是否存在耐藥問題，有待于研究。因此調(diào)查中草藥對臨床常見病原菌抑菌狀況、了解中草藥與抗生素聯(lián)合應(yīng)用治療感染，減少抗生素耐藥菌株產(chǎn)生，解決病原菌多重耐藥問題具有重要意義。 [目的]： 1．研

4、究臨床住院患者致病菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)耐藥菌譜及致病菌攜帶耐藥酶比。 2．研究中草藥對臨床常見病原菌抑菌效果，為臨床分析用藥提供客觀的實驗室依據(jù)，為中草藥聯(lián)合抗生素治療細菌感染性疾病提供客觀論據(jù)。 [方法]： 1．標本及來源：病原菌276株，分別來自2005年2月～2006年12月山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院住院感染患者的標本分離株，其中大腸埃希81株，肺炎克雷伯菌46株，銅綠假

5、單胞菌92株，金黃色葡萄球菌57株。 2．耐藥譜檢測及耐藥酶表型測定： (1)抗生素藥敏：應(yīng)用Kirby-Bauer法，將0.5麥氏單位菌液均勻涂布整個瓊脂平板，分別用24種抗生素：阿米卡星、阿奇霉素、阿莫西林、氨曲南、氨卞西林、頭孢曲松、舒普深、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢呋新鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、左旋氧氟沙星、諾氟沙星、哌拉西林、氨卞西林/

6、舒巴坦、替卡西林/棒酸、妥布霉素、特治星、亞胺培南、米諾環(huán)素、美洛培南、克林霉素、紅霉素、呋喃妥因、氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、喹奴普汀/達福普汀、利福平、復(fù)方新諾明、替考拉寧、萬古霉素、四環(huán)素的藥敏紙片，貼于平板表面，35℃孵育18～24h后，獲取抑菌環(huán)直徑，從而測定大腸埃希菌，肺炎克雷伯菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌的耐藥譜，按照臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSR)制定的標準，判定其耐藥結(jié)果。用WHONET軟件進行統(tǒng)計，分析耐藥率，對

7、比攜帶耐藥酶與非耐藥酶病原菌耐藥譜的差異。 (2)ESBLs的表型確證試驗：菌液涂布瓊脂平皿及貼藥敏紙片的方法同上，按照臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSR)制定的標準，確定耐藥酶：當頭孢他啶、頭孢噻肟2種藥物中有任何一種，在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑相比，增大數(shù)值≥5衄時，判定為產(chǎn)ESBLs。 (3)誘導(dǎo)酶測定：采用紙片相鄰法，菌液涂布瓊脂平皿及貼藥敏紙片的方法同上，以亞胺培南為誘導(dǎo)劑貼在平皿中央，以

8、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸，作為β-內(nèi)酰胺酶的靶目標物，貼在亞胺培南的周圍，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果，作為目標物的抗菌素紙片在朝向亞胺培南側(cè)的抑菌環(huán)有一切面，呈不完全抑菌環(huán)(或截平抑菌環(huán))，而遠離亞胺培南側(cè)的抑菌環(huán)呈完全抑菌環(huán)，如完全抑菌環(huán)側(cè)半徑與截平抑菌環(huán)側(cè)半徑的差值大于4mm即判為誘導(dǎo)酶陽性。 3．中藥抗菌譜初步檢測： (1)中藥提?。捍笄嗳~、苦參、連翹、金銀花、夏枯草各20

9、0g，經(jīng)微型植物粉碎機粉碎后，用90％乙醇浸泡24h，過濾至燒杯后，用直流電熱套蒸發(fā)濃縮至200ml，獲得提取液(濃度為1g/ml)。 (2) 中藥抑菌試驗(牛津小杯方法)：涂布平板同K-B法。平板背面標明中藥名稱，用無菌鑷子取牛津小杯，放于所標相應(yīng)藥名的瓊脂平板上，用加液器無菌操作吸入不同藥液，分別注入相對應(yīng)牛津小杯內(nèi)至滿，放于35℃孵箱內(nèi)，孵育8～12h后，標尺測量抑菌環(huán)直徑，分析和對比中草藥對病原菌的抑制狀況。 [

10、結(jié)果]： 1．大腸埃希菌耐藥率最低為亞胺培南和美洛培南，其結(jié)果全部敏感。低于50％的藥物為：頭孢他啶/克拉維酸3.70％、特治星19.75％、頭孢噻肟/克拉維酸20.99％、頭孢他啶23.46％、阿米卡星25.92％、舒普深40.74％。同時耐藥率最高的前五位為：氨卞西林93.83％、哌拉西林91.36％、環(huán)丙沙星87.65％、諾氟沙星86.42％、頭孢哌酮79.01％。攜帶ESBLs的大腸埃希菌株檢出率69.14％。亞胺培南和

11、美洛培南未見耐藥株。耐藥率低于50％為：頭孢他啶/克拉維酸3.57％、特治星26.79％、頭孢噻肟/克拉維酸30.36％、頭孢他啶和阿米卡星為32.14％。同時耐藥率最高的為氨卞西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢呋新鈉、哌拉西林，耐藥率高達100％，其次環(huán)丙沙星和諾氟沙星為96.43％。 2．肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美洛培南抗生素全部敏感，其次耐藥率最低前五位中：頭孢他啶/克拉維酸6.52％、頭孢他啶21.74％、頭孢噻肟

12、/克拉維酸28.26％、特治星和頭孢吡肟30.43％。同時耐藥率高于60％為：氨卞西林97.83％、哌拉西林和米諾環(huán)素73.91％。攜帶ESBLs肺炎克雷伯菌株檢出率41.30％。其中耐藥率低于50％為：頭孢他啶/克拉維酸5.26％、頭孢他啶42.11％、頭孢噻肟/克拉維酸和特治星47.37％。同時耐藥率最高為氨卞西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢呋新鈉、哌拉西林，耐藥率高達100％，其次為氨卞西林/舒巴坦89.47％、米諾環(huán)素和

13、妥布霉素84.21％、替卡西林/棒酸78.95％、氨曲南和諾氟沙星73.68％。 3．銅綠假單胞菌耐藥率高于的80％為：氨卞西林100％、頭孢呋新鈉100％、米諾環(huán)素98.91％、氨卞西林/舒巴坦97.83％、頭孢噻肟83.70％、頭孢噻肟/克拉維酸81.52％。耐藥率最低的前四位抗生素為：頭孢他啶/克拉維酸22.83％、阿米卡星23.92％、頭孢他啶和頭孢吡肟25.00％。銅綠假單胞菌對亞胺培南和美洛培南耐藥率為31.52％和

14、38.04％。對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、氟喹諾酮類和亞胺培南等常用抗菌藥物全部耐藥的泛耐藥銅綠假單胞菌菌株為5株，檢出率為：5/92。銅綠假單胞菌經(jīng)誘導(dǎo)試驗獲得產(chǎn)誘導(dǎo)酶菌株共21株。 4．耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率52.6％(30/57)。MRSA比MSSA耐藥率高，MRSA耐藥率為100％的藥物為：阿奇霉素、克林霉素、紅霉素、頭孢西丁、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、氨卞西林。MSSA大于80％的藥物為：青霉素100％、哌拉

15、西林100％、氨卞西林92.59％。金黃色葡萄球菌耐藥率低的藥物：萬古霉素全部敏感、替考拉寧1.75％、喹奴普汀/達福普汀3.51％、呋喃妥因和復(fù)方新諾明3.51％。 5．所試中藥對多數(shù)大腸埃希菌抑菌效果不明顯，只有少數(shù)菌株出現(xiàn)大于/等于10mm的抑菌環(huán)：連翹8.64％(7/81)、金銀花7.41％(6/81)、大青葉6.17％(5/81)、夏枯草4.94％(4/81)、苦參3.70％(3/81)；同樣，肺炎克雷伯菌：連翹10.

16、87％(5/46)、大青葉8.70％(4/46)、金銀花6.52％(3/46)、苦參2.17％(1/46)、夏枯草2.17％(1/46)；而銅綠假單胞菌：大青葉15.22％(14/92)、連翹11.96％(11/92)、金銀花5.43％(5/92)、夏枯草4.35％(4/92)、苦參2.17％(2/92)、相對于上述革蘭氏陰性桿菌，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)大于/等于10mm的抑菌環(huán)的菌株較多：大青葉96.49％(55/57)、苦參85.96％

17、(49/57)、連翹78.95％(45/57)、金銀花50.88％(29/57)、夏枯草36.84％(21/57)。 [結(jié)論]： 1．大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌具有嚴重耐藥現(xiàn)象，提示臨床應(yīng)用抗生素需在藥敏實驗指導(dǎo)下進行。 2．攜帶ESBLs與非攜帶ESBLs菌株耐藥譜具有顯著差異，攜帶ESBLs菌株耐藥譜更廣。 3．MRSA與MSSA耐藥譜有顯著性差異，MRSA耐藥譜更廣。