多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥危險因素調查及相關耐藥機制研究.pdf

1、目的：
　　 1．探究MDRPa的醫(yī)院感染及耐藥產(chǎn)生的危險因素，為臨床合理選藥和防治MDRPa感染提供科學依據(jù)；監(jiān)測我院MDRPa的醫(yī)院感染情況，為確定院內交叉感染發(fā)生及控制提供依據(jù)。
　　 2．研究Opr突變或缺失和外排泵類型及高表達在本院MDRPa對碳青霉烯類耐藥中發(fā)揮的作用；了解高突變菌株的分離情況及氟喹諾酮類抗菌藥物的誘導突變情況，探究誘導后銅綠假單胞菌的耐藥機制；了解MDRPa的多重耐藥性及相關機理。
　

2、　 方法：
　　 1．采用RAPD-PCR技術對本院2009年7月～2010年7月分離的120株MDRPa的同源性進行分析。設病例一對照研究方法，運用t檢驗、x2檢驗、非條件Logistic回歸等方法分析MDRPa對多重耐藥的產(chǎn)生及醫(yī)院感染的危險因素。
　　 2．采用EDTA雙紙片協(xié)同試驗和EDTA雙紙片增效試驗檢測MDRPa中產(chǎn)金屬β內酰胺酶情況，比較兩種方法的差異性。改良Hodge試驗檢測產(chǎn)KPC酶情況。引用KPC

3、、IMP、VIM、SPM、GIM、Opr等基因的引物，測定相應的耐藥基因攜帶情況。RealtimeRT-PCR檢測OprD相對表達量，SDS-PAGE電泳半定量分析其蛋白質表達量；測序比對部分耐藥菌株的Opr全序列。
　　 3．RealtimeRT-PCR測定MexB、MexD、MexXmRNA的相對表達量及測序調控基因mexR和nalC;外排泵抑制劑CCCP聯(lián)合抗生素使用檢測MDRPa的MIC變化。
　　 4．采用高濃

4、度利福平耐藥生長試驗檢測多重耐藥菌株和全敏感菌株的突變體及突變頻率。測定低濃度肉湯傳代誘導對環(huán)丙沙星的耐藥能力及誘導后相關耐藥基因的突變情況。
　　 5．PCR檢測MDRPa的整合酶、氨基糖苷類鈍化酶及超廣譜β內酰胺酶等相關基因。
　　 結果：
　　 1.120株MDRPa同源性分析共分16個基因型，主要包括6個克隆株；患者住院科室、使用呼吸機、感染前住院天數(shù)、性別和使用三代頭孢、支氣管灌洗、機械通氣、碳青酶烯類

5、及酶抑制劑類抗生素等與銅綠假單胞菌多重耐藥性有關，主要有支氣管灌洗和機械通氣(OR值分別為13.944，15);MDRPa對各類抗菌藥物的耐藥產(chǎn)生危險因素各不相同：亞胺培南耐藥產(chǎn)生危險因素主要為ICU和神經(jīng)外科病房(OR值分別為22、14.667);頭孢哌酮/舒巴坦耐藥產(chǎn)生危險因素包括住院天數(shù)為80-104天及＞105天和ICU病房(OR值分別11.083、12.667、25)。
　　 2．EDTA雙紙片協(xié)同試驗檢測到28株陽性

6、，陽性率為47.45％;EDTA雙紙片增效試驗檢測到29株陽性，陽性率為49.15％，兩種方法間沒有顯著性差異(x2=2.131，P=0.144)；PCR檢出2株IMP-1陽性，未檢測到KPC、GIM、SPM和VIM等基因；OprD缺失7株；Opr中堿基突變主要集中在1010-1136bp和1212-1355bp區(qū)域，此區(qū)域各堿基位點的突變頻率各不相同，且與表達量之間沒有直接的相關性。
　　 3.30株MDRPa均存在MexB和

7、MexD，僅有20株存在MexX,其中高表達MexB、MexD和MexX分別有30株、25株和6株；MexB高表達株與抗菌藥物TET、CIP、GEN的MIC值變化有著密切關系(P分別為0.045、0.002、0.031)，但與CTX的MIC值變化沒有確切的相關性(P=0.538);TET、CIP、GEN、CTX聯(lián)合EPI前后MIC變化四者之間差異有統(tǒng)計學意義(x2=25.265，P=0.003)。兩兩比較經(jīng)“行×列”x2分割法設定檢驗水

8、準α’=0.0071，發(fā)現(xiàn)CTX和CIP兩者之間MIC變化分布差異無統(tǒng)計學意義(x2=7.842，P=0.049)，CTX和GEN兩者之間MIC變化分布差異有統(tǒng)計學意義(x2=10.299，P=0.006)，CTX和TET兩者之間MIC變化分布差異有統(tǒng)計學意義(x2=19.195，P=0.000)，而TET、CIP、GEN三者兩兩之間差異均無統(tǒng)計學意義。選取10株MexB高表達株測序mexR和nalC:有1株同時發(fā)生了mexR378T→

9、A替代和nalC279G→A替換、755T缺失，有5株發(fā)生nalC279G→A替換和755T缺失，有1株發(fā)生了nalC279G→A、721A→T替換，1株僅發(fā)生了nalC279G→A。
　　 4．多重耐藥菌株的突變頻率顯著高于全敏感菌株(U=-4.603，P=0.000)；誘導結果顯示28株對左氧氟沙星耐藥，其中6株被誘導成多重耐藥菌株；誘導后突變頻率明顯高于誘導前(t=-2.57，P=0.01);誘導后耐藥機制：6株發(fā)生gyr

10、AThr83(ACC)→Ile(ATC)位點突變，未發(fā)現(xiàn)par突變；誘導后MexB、MexD、MexX表達上調的分別有15株、17株、5株(3株超高表達)。選取8株MexAB-OprM高表達株測序mexR和nalC，1株mexR突變，8株nalC突變。
　　 5.35株攜帶有Ⅰ類整合酶基因，都伴有qacE△l-Sull，共有9種不同類型基因盒；106株AmpC‘酶陽性，ESBL包括CARB20株、OXA-1015株、PER-13

11、株、CTX-M5株；大部分菌株均產(chǎn)生氨基糖苷鈍化酶包括乙酰轉移酶(AAC):aac3Ⅱ96株，ant6169株，aac3Ⅳ27株，aac(6″)Ⅱ10株；核苷轉移酶(ANT):ant2″I23株，ant3″Ⅱ12株，aac3120株，ant(3")19株，rmtB7株，armA8株；發(fā)生gyrA突變28株，par突變35株；質粒Qnr均為陰性；
　　 結論：
　　 1．本院多重耐藥菌主要有6種流行克隆株，MDRPa醫(yī)院感

12、染可能與分離出MDRPa14天內使用碳青霉烯類、三代頭孢菌素及酶抑制劑類抗菌藥物、機械通氣、氣管插管及切開、支氣管灌洗、基礎疾病、住院時間長短等密切相關，其對各類抗菌藥物的耐藥危險因素也各不相同。
　　 2.OprD2蛋白的突變或表達量降低和外排泵的高表達是我院MDRPa碳青霉烯類耐藥的主要機制，極少部分菌株通過產(chǎn)酶機制導致耐藥。突變位點多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)堿基突變主要集中在堿基1010-1136bp和1212-1355bp區(qū)域，此區(qū)

13、域各堿基位點的突變頻率各不相同，且與表達量之間沒有直接的相關性，并發(fā)現(xiàn)部分新的堿基突變位點。
　　 3．主動外排系統(tǒng)在我院MDRPa表達率很高，外排泵MexAB-OprM普遍高表達是此菌多重耐藥機制之一：其高表達與調控基因mexR、nalC發(fā)生變異有關，同時存在其他調控機制。MexAB-OprM高表達菌株與抗菌藥物TET、CIP、GEN的MIC值變化有著密切關系。
　　 4．多重耐藥菌的突變頻率很高，全敏感臨床分離株環(huán)丙

14、沙星誘導后突變頻率明顯增高，且可呈現(xiàn)多重耐藥性，耐藥機制主要以外排泵高表達、gyrA突變以及OprD突變。
　　 5．本院MDRPa耐藥機制復雜多樣，攜帶多種耐藥基因，研究揭示產(chǎn)生AmpC酶、CARB、OXA型ESBL、aac(3)11、ant6I及aac3Ⅳ氨基糖苷鈍化酶、發(fā)生gyrA和par突變，以及OprD2蛋白突變缺失和外排泵高表達是造成銅綠假單胞菌對臨床常用的第三、四代頭孢菌素、酶抑制劑復方制劑、氟喹諾酮類、碳青霉烯類