糞腸球菌利奈唑胺耐藥機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：⑴通過(guò)利奈唑胺(LZD)體外誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥，篩選系列耐藥菌株，進(jìn)行藥敏鑒定，獲得不同最小抑菌濃度(MIC)梯度的菌株群。⑵比較糞腸球菌母株和利奈唑胺誘導(dǎo)耐藥菌株之間23 SrRNAV區(qū)基因序列的差異，分析23 SrRNA V區(qū)基因在耐藥發(fā)生過(guò)程中的變化規(guī)律及意義，為深入研究其耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：①篩選4株糞腸球菌母株:其中3株糞腸球菌(F1-F3)來(lái)源于深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院2010年11月至2012年12月微

2、生物實(shí)驗(yàn)室收集的臨床菌株標(biāo)本，為不同時(shí)間獲得的血流培養(yǎng)陽(yáng)性的致病菌株;另一株為糞腸球菌質(zhì)控菌株ATCC29212(F4)。②耐藥菌株的誘導(dǎo)和鑒定:用微量肉湯稀釋法同時(shí)測(cè)定糞腸球菌臨床分離菌株和質(zhì)控菌株對(duì)LZD的MIC值。然后將4株糞腸球菌依次接種在LZD濃度成倍增加的M-H瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行梯度篩選培養(yǎng)并篩選陽(yáng)性克隆，PhoenixTM100自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，采用2009年CLSI標(biāo)準(zhǔn)推薦的微量肉湯稀釋法法再

3、次驗(yàn)證系列誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)LZD的MIC值，建立糞腸球菌對(duì)LZD不同MIC值梯度的菌株群。③提取糞腸球菌母株及鑒定的耐藥菌株的DNA，采用常規(guī)PCR檢測(cè)細(xì)菌各組誘導(dǎo)株23 SrRNAV區(qū)4個(gè)拷貝數(shù)基因，PCR產(chǎn)物純化后連接T載體送華大基因測(cè)序，將耐藥菌株的23SrRNA V區(qū)基因序列與母株序列進(jìn)行比對(duì)，獲得耐藥菌株基因位點(diǎn)變異分布情況。④進(jìn)一步分析23SrRNA V區(qū)基因變異位點(diǎn)發(fā)生與細(xì)菌MIC值之間的關(guān)系及在耐藥發(fā)生過(guò)程中的可能作用和意

4、義。
　　 結(jié)果：⑴對(duì)3株臨床分離的糞腸球菌及質(zhì)控菌株ATCC29212進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)，組建糞腸球菌對(duì)LZD不同MIC值梯度的菌株群（包括1-256ug/ml組），其中F1鑒定獲得耐藥菌株9株;F2鑒定獲得6株;F3鑒定獲得4株;F4鑒定獲得12株。⑵對(duì)糞腸球菌母株和利奈唑胺誘導(dǎo)后的耐藥菌株23 SrRNAV區(qū)進(jìn)行基因測(cè)序，F(xiàn)1母株、F2母株、F3母株、F4母株無(wú)位點(diǎn)變異，各誘導(dǎo)菌株在母株基礎(chǔ)上均出現(xiàn)位點(diǎn)變異，主要的變異位

5、點(diǎn)為G2576U，另有T2504A、G2505A、C2610A、C2424U等位點(diǎn)變異。不同菌株出現(xiàn)的位點(diǎn)變異分布亦有不同，其中F1組菌株以G2576U、C2424U兩種變異形式為主;F2及F3組菌株則以G2576U變異為主;F4組菌株中，包含G2505A、T2504A、G2576U、C2610A等4種形式的變異。不同片段的變異情況亦有差異，R3及R4片段容易發(fā)生位點(diǎn)變異，R1次之，R2最難。⑶F1-F4菌株的對(duì)LZD的MIC值與23S

6、rRNAV區(qū)基因變異的變化規(guī)律:F1組菌株在耐藥早期出現(xiàn)2個(gè)23SrRNAV區(qū)位點(diǎn)變異，隨著MIC值增加，在高水平耐藥時(shí)出現(xiàn)4個(gè)23SrRNA V區(qū)位點(diǎn)變異;F2組菌株在耐藥早期即出現(xiàn)4個(gè)拷貝基因位點(diǎn)變異;F3組菌株在耐藥中介期即出現(xiàn)2個(gè)拷貝基因位點(diǎn)變異，在MIC值達(dá)到256μg/ml時(shí)增加為4個(gè);F4組菌株在耐藥早期僅有1個(gè)拷貝基因位點(diǎn)變異，在MIC值達(dá)到96μg/ml時(shí)才開始增加為4個(gè)，MIC值隨著突變數(shù)量的增多而增高，但有些23

7、SrRNAV區(qū)位點(diǎn)變異拷貝數(shù)與耐藥程度并不成比例。
　　 結(jié)論：①通過(guò)利奈唑胺體外誘導(dǎo)糞腸球菌耐藥實(shí)驗(yàn)，可獲得利奈唑胺耐藥的糞腸球菌。經(jīng)藥敏試驗(yàn)證實(shí)，系列誘導(dǎo)耐藥菌株對(duì)LZD的MIC值較誘導(dǎo)前顯著增高。②糞腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥與該細(xì)菌23SrRNA基因發(fā)生點(diǎn)突變有關(guān)，主要的突變位點(diǎn)是23SrRNA V區(qū)2576位點(diǎn)。其他位點(diǎn)變異，如T2504A、G2505A、C2610A、C2424U等，也可能導(dǎo)致糞腸球菌耐藥。③利奈唑胺耐藥的