糞腸球菌生物學(xué)特性研究.pdf

1、糞腸球菌是口腔中常見(jiàn)的致病菌，是導(dǎo)致人類(lèi)疾病的腸球菌中最常見(jiàn)的一種病原菌，尤其是在根管再感染的樣本中，糞腸球菌是檢出率最高的細(xì)菌。糞腸球菌通過(guò)形成生物膜的形式引起感染。同時(shí)，糞腸球菌的致病能力與其表面蛋白的種類(lèi)和功能密切相關(guān)。細(xì)菌表面蛋白是理解其與宿主相關(guān)行為的關(guān)鍵分子。這些蛋白參與細(xì)胞壁形成與維持，與宿主的相互反應(yīng)，以及毒力因子。分析糞腸球菌能夠逃逸根管治療過(guò)程中多種抑菌手段的機(jī)制，對(duì)于預(yù)防并治療根管治療失敗所致的再次感染，具有很好的

2、臨床意義。
　　本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分?jǐn)M在實(shí)驗(yàn)室條件下，摸索不同條件的誘導(dǎo)方法成功的在體外誘導(dǎo)糞腸球菌進(jìn)入“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)，并分析在此狀態(tài)下糞腸球菌的生理，生化特性，以及與其致病能力相關(guān)的特性，如形態(tài)學(xué)，代謝特點(diǎn)，產(chǎn)酸耐酸能力，粘附能力，基因表達(dá)變化情況等進(jìn)行相關(guān)研究。
　　結(jié)果顯示：糞腸球菌在多種惡劣的條件下均能夠進(jìn)入到“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)，并通過(guò)發(fā)生形態(tài)改變，減少代謝反應(yīng)和基因表達(dá)等生理性活動(dòng)，抵抗

3、環(huán)境變化帶來(lái)的損害。同時(shí)，在此狀態(tài)下的糞腸球菌仍具有一定的產(chǎn)酸，粘附等致病能力并表達(dá)一部分致病相關(guān)的基因。在適宜條件下，“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)下的糞腸球菌能夠恢復(fù)細(xì)胞增長(zhǎng)分裂，以及致病能力，對(duì)宿主健康產(chǎn)生威脅。
　　第二部分使用質(zhì)譜非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)的糞腸球菌的表面蛋白表達(dá)的差異進(jìn)行研究。分析兩種狀態(tài)糞腸球菌表面蛋白表達(dá)量差別及其代表的相關(guān)功能差異，進(jìn)一步探索糞腸球菌以生物膜形式致病的機(jī)制。結(jié)果顯示：與

4、浮游狀態(tài)的糞腸球菌相比，生物膜狀態(tài)的糞腸球菌其表面蛋白表達(dá)具有明顯差異的蛋白有303種，其中108種差異倍數(shù)在2倍以上（73種蛋白表達(dá)上調(diào)，35種表達(dá)下調(diào)）。分析全部的108種識(shí)別蛋白可知，其中有71種差異蛋白鑒定為胞漿蛋白，多為核糖體蛋白類(lèi)或延長(zhǎng)因子，而另外37種差異蛋白則鑒定為細(xì)菌表面相關(guān)蛋白。大部分的表面相關(guān)蛋白在糞腸球菌生物膜組表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。糞腸球菌表達(dá)差異的37種表面相關(guān)蛋白中，有5種蛋白以LPxTG的方式錨定于細(xì)胞壁；17

5、種蛋白具有脂類(lèi)錨定，推測(cè)為胞外蛋白，其功能多以細(xì)胞胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白SBPs的形式；其余15種蛋白為膜蛋白，其中6種蛋白具有N-端錨定，9種蛋白具有多跨膜區(qū)段TMHs。
　　第三部分使用深度測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)生物膜狀態(tài)糞腸球菌全基因組范圍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序并繪制通路圖譜。結(jié)果顯示：測(cè)序獲得生物膜狀態(tài)糞腸球菌可匹配Reads數(shù)為26911175，經(jīng)拼接獲得2552個(gè)轉(zhuǎn)錄本；其中有1657個(gè)轉(zhuǎn)錄本可共同對(duì)比到4個(gè)參考基因組；共19

6、13個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋到參考基因，其余639個(gè)采用序列相似對(duì)比后有387個(gè)轉(zhuǎn)錄本可以對(duì)比上NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白；1763個(gè)轉(zhuǎn)錄本分類(lèi)到不同的COG功能中，多集中于信息儲(chǔ)存與處理，代謝，以及細(xì)胞進(jìn)程和信號(hào)肽等；KEGG分析得到170條通路，排除真核生物后得到74條KEGG pathway，顯著富集于能量及物質(zhì)代謝，復(fù)制和修復(fù)，轉(zhuǎn)錄，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及聚糖合成與代謝等細(xì)胞進(jìn)程。
　　本課題研究結(jié)果從一定程度上證明了糞腸球菌進(jìn)入“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)

7、是其抵抗惡劣環(huán)境的一個(gè)可能機(jī)制；糞腸球菌的表面蛋白多與細(xì)胞壁合成及維持，細(xì)菌粘附作用，毒力因子以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)，這些表面蛋白也可能參與一些細(xì)菌活動(dòng)，例如溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及生物素調(diào)控過(guò)程等；生物膜狀態(tài)下的糞腸球菌，能量及物質(zhì)代謝活躍，細(xì)胞增值速度加快，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及信息通路等細(xì)胞進(jìn)程均參與了糞腸球菌的毒力及致病過(guò)程。
　　研究結(jié)果從理論上進(jìn)一步補(bǔ)充了根管感染的細(xì)菌病因?qū)W學(xué)說(shuō)，生物膜狀態(tài)糞腸球菌的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，為深入理解糞