腸球菌生物學(xué)特性

1、腸球菌,梁文星,1. 簡(jiǎn)介,D。腸球菌通常從食品、植物、水和土壤中分離，在牛奶和奶酪制品中通常會(huì)找到糞腸球菌、屎腸球菌和少量的堅(jiān)忍腸球菌，偶然也會(huì)發(fā)現(xiàn)小腸腸球菌和鉛黃腸球菌；,C。糞腸球菌和屎腸球菌都是人類消化道微生物自然存在的菌種，在胃腸道中因?yàn)閭€(gè)體差異其含量差異變化很大（在每克消化系統(tǒng)內(nèi)容物中含有102和108）；,A。腸球菌最初列為D群鏈球菌，1984年經(jīng)過DNA-DNA和DNA-RNA雜交才被列為腸球菌屬，到目前為止32種菌已

2、被列入腸球菌屬；,B。腸球菌種適宜在6.5％氯化鈉，40％膽汁鹽且pH值在9.6，并可以在60°C的環(huán)境下生存30分鐘，大多數(shù)品種也可以在10℃至45℃之間生長(zhǎng)；,1. 簡(jiǎn)介,E。不同于其他乳酸菌，腸球菌不能被認(rèn)為是“一般認(rèn)為安全”（GRAS），并且它在水中檢測(cè)是作為糞便污染物的指標(biāo)的；,F。對(duì)于腸球菌的安全評(píng)價(jià)程序是一個(gè)不太確定的狀況一方面，腸球菌在作為奶酪技術(shù)中作為發(fā)酵劑培養(yǎng)物被認(rèn)為是有積極作用的另一方面，它們被認(rèn)

3、為是新興的人類病原體；,G。這篇綜述主要是根據(jù)現(xiàn)有知識(shí)總結(jié)了腸球菌的積極和消極的性狀特點(diǎn)，來描述這種菌屬的爭(zhēng)議性食品安全準(zhǔn)則著重強(qiáng)調(diào)了對(duì)抗生素耐藥性和毒力的因素，因此我們建議在發(fā)酵食品中使用腸球菌前應(yīng)對(duì)這幾項(xiàng)進(jìn)行研究。,2. 分類和鑒定,*由于腸球菌的表型多樣性，這使得腸球菌種的生理測(cè)試鑒定一直存在問題。此外，物種鑒定的常規(guī)實(shí)驗(yàn)往往需要很長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間*使用16S和23S rDNA基因的基因型鑒定方法更加的準(zhǔn)確，雖然它們還不能區(qū)分

4、所有腸球菌的物種（例如鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌有99.8%的16S rDNA的同源性）。,*這種方法已經(jīng)成功的在應(yīng)用：1）rRNA基因間隔區(qū)的特異PCR擴(kuò)增技術(shù)，ddl和van基因，ace 基因，sodA 基因，2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因Ef0027的擴(kuò)增，3）ddl 基因，cpn60 基因和atpA 基因的測(cè)序，4）利用5‘端引物（GTG）的細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)。,2. 分類和鑒定,*有許多人試圖區(qū)分從人分離的菌株和從食物分離的菌株

5、,大部分主要關(guān)注的DNA指紋圖譜。,*這些研究使用了多種分子分型方法，如擴(kuò)增rDNA限制性分析，脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）的DNA宏觀限制模式，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）- PCR檢測(cè)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)。,*脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）已成功地用于區(qū)分臨床和食品菌株之間的差異，以及從家禽和住院患者分離的菌株的差異。雖然電泳是區(qū)分腸球菌屬菌株的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是它比較昂貴且耗時(shí)和比較復(fù)雜。,2. 分類和鑒定,*最近

6、，有兩種方法被證明比PFGE更有辨識(shí)力，一種是基于管家基因的核苷酸序列的多位點(diǎn)序列分型（MLST），另有一種是基于可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的多位變量分析（MLVA）,* MLSA是屎腸球菌株的流行病學(xué)分析的一種極好的方法，它與MLVA都能很好的替代PFGE。盡管腸球菌的分子分型方法在很大范圍內(nèi)都有效，并且MLST的流行病學(xué)分析方法都是很有效的方法，但它們?nèi)匀浑y以明確區(qū)分食品株系和臨床株系。,3. 腸球菌在乳制品中的作用,*奶酪中腸球菌的使

7、用備受爭(zhēng)議。在南歐國(guó)家中腸球菌對(duì)于奶酪風(fēng)味的影響是必要的因素（表1），但在北歐大多數(shù)國(guó)家中對(duì)這持否定的態(tài)度。這些不同的觀點(diǎn)可能僅僅是由于文化差異；,*腸球菌污染牛奶要么是直接來自于動(dòng)物糞便，要么是間接的來自污染的水源，擠奶設(shè)備或者是散裝的儲(chǔ)存罐；,*在地中海式奶酪凝乳中腸球菌的范圍從104到106CFU/g，而在完全成熟的奶酪菌落數(shù)達(dá)到105到107CFU/g。,3. 腸球菌在乳制品中的作用,表1 與腸球菌有關(guān)的奶酪產(chǎn)品（表中不太詳盡

8、）,3. 腸球菌在乳制品中的作用,積極作用1）乳品株腸球菌對(duì)于傳統(tǒng)奶酪成熟具有積極的作用；2）腸球菌對(duì)于奶酪的成熟和香氣的形成都有很大的幫助，例如切達(dá)干酪、羊乳酪、Water-buffalo、 Mozarella、Cebreiro、Venaco和 Hispanico都是由于他們蛋白水解和酯水解和他們通過檸檬酸鹽的新陳代謝產(chǎn)生的雙乙酰產(chǎn)品；3）除了他們的工藝性能，許多的腸球菌株（主要是糞腸球菌和屎腸球菌）生產(chǎn)的細(xì)菌素能夠抑制李斯

9、特菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和霍亂弧菌。*由于他們?cè)谀汤页墒?、風(fēng)味形成和細(xì)菌素的生產(chǎn)的作用，表明了這個(gè)具有理想的技術(shù)和代謝特點(diǎn)的腸球菌可以用做各種奶酪的發(fā)酵劑培養(yǎng)物,3. 腸球菌在乳制品中的作用,消極作用對(duì)于腸球菌在奶酪的消極作用可能是由于它們能夠生產(chǎn)生物胺。在生產(chǎn)奶酪和發(fā)酵香腸時(shí)產(chǎn)生的生物胺中一些腸球菌株被定義為有害的。,鑒于其共生的狀態(tài)，腸球菌也被用來作為人或家畜的益生菌。益生菌發(fā)酵乳商業(yè)上稱為Gaio，這里面

10、包含有是腸球菌菌株，在丹麥已經(jīng)商業(yè)化。 腸球菌SF68已被用來治療腹瀉，并可以替代抗生素的治療。另一種腸球菌的益生菌的使用是CausidoR培養(yǎng)，它包括嗜熱鏈球菌和糞腸球菌兩種菌株。 然而，作為一種益生菌腸球菌或作為奶酪的起始發(fā)酵的使用仍存在爭(zhēng)議，這是因?yàn)樗哪退幮院投玖驅(qū)θ祟惾杂酗L(fēng)險(xiǎn)。2004年，加拿大禁止了益生菌腸球菌的使用。,4. 腸球菌和人類的健康,4.1腸球菌為條件致病菌,雖然腸球菌已經(jīng)使用了幾個(gè)

11、世紀(jì)，并沒有明確地把它作為劇毒的有機(jī)體，他們現(xiàn)在已經(jīng)成為全球院內(nèi)感染的重要原因； 在美國(guó)腸球菌是引起醫(yī)院血液感染的第三大最常見原因，在歐洲排第四；,,,腸球菌的感染主要是糞腸球菌和屎腸球菌引起的，其中臨床菌株分別高達(dá)80%和20。最近的研究表明，屎腸球菌感染的比例有所增加，主要是由于對(duì)抗生素有耐藥性的腸球菌株越來越多；,,其他的腸球菌菌種例如堅(jiān)忍腸球菌、鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌、棉子糖腸球菌較少的與腸球菌感染有牽連。

12、,,4. 腸球菌和人類的健康,腸球菌對(duì)于健康個(gè)體是無害的，腸球菌臨床菌株主要使重癥監(jiān)護(hù)病房患者及嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的病人或免疫系統(tǒng)受損病人，或者是老人病院的病人致病。 腸球菌常與其他病原體的多種微生物腹內(nèi)感染有關(guān)系，因此很難確定它在感染中的作用。 腸球菌是泌尿道感染，菌血癥，心內(nèi)膜炎和后發(fā)性白內(nèi)障手術(shù)術(shù)后并發(fā)癥有關(guān)，這點(diǎn)已經(jīng)很明確。 在歐洲和美國(guó)腸球菌導(dǎo)致尿道感染（UTIs）排名第二,,,,,4. 腸球

13、菌和人類的健康,腸球菌易位穿過整個(gè)腸道粘膜屏障會(huì)導(dǎo)致菌血癥。其他可以確認(rèn)的腸球菌菌血癥的來源包括靜脈注射管、膿腫和尿道感染。 腸球菌菌血癥的死亡率的危險(xiǎn)因素包括疾病的嚴(yán)重程度，年齡和廣譜抗生素的使用。 腸球菌菌血癥可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎，這對(duì)于治療腸球菌感染血液來說是最大的挑戰(zhàn)，并且它一直與死亡率的增加有關(guān)。 在鏈球菌和金黃色葡萄球菌之后，腸球菌（主要是糞腸球菌）是引起心內(nèi)膜炎的第三大原因，5-20%的心內(nèi)膜

14、炎癥都是由它引起的。,,,,,4. 腸球菌和人類的健康,雖然對(duì)于腸球菌感染的主要危險(xiǎn)因素仍有爭(zhēng)論，但對(duì)于未能采取衛(wèi)生保護(hù)措施，預(yù)先的抗生素治療，長(zhǎng)時(shí)間的住院以及腸球菌出現(xiàn)在泌尿系統(tǒng)或血管導(dǎo)管中，這是公認(rèn)的導(dǎo)致腸球菌感染的危險(xiǎn)因素。 雖然各個(gè)醫(yī)院病房對(duì)于死亡率的研究各不相同，但其平均死亡率大約是20%到30%,,,4. 腸球菌和人類的健康,4.2抗生素耐藥性,糞腸球菌和屎腸球菌抗生素耐藥性的趨勢(shì)得到了廣泛的審查。大部分是研究

15、臨床腸球菌株和人腸球菌株，因?yàn)樗麄冇泻芨叩呐R床影響。 腸球菌的硬度特性賦予它一個(gè)特性，使它對(duì)于幾類低濃度的抗生素的能夠有異常高的固有的耐藥性，這幾類抗生素包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類（第三代頭孢菌素類）和喹諾酮類。特別是屎腸球菌臨床分離株能夠耐受高濃度的青霉素。 除了其固有的耐受性/抵抗水平，腸球菌已獲得了遺傳因素使其能抵抗多種類的抗生素，特別是糖肽類抗生素（萬古霉素和替考拉寧），以及對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗

16、生素的協(xié)同作用。,,,,4. 腸球菌和人類的健康,特別是，萬古霉素抗藥性腸球菌（VRE）構(gòu)成人體臨床治療感染的一個(gè)主要原因，因?yàn)檫@種藥物是作為最后手段來治療對(duì)多種抗生素具有抗藥性的腸球菌。 萬古霉素的抗藥性有的是先天固有的(vanC)，有的是后天獲得的(vanA, vanB, vanD, vanE, vanG) 。1）最常見的轉(zhuǎn)移萬古霉素耐藥表型是vanA，它是一個(gè)高層次的誘導(dǎo)抗性和替考拉寧交互抗性相關(guān)的萬古霉素，2）另

17、一種表型是vanB，它通常只對(duì)萬古霉素顯示誘導(dǎo)抗性參差不齊。,,,4. 腸球菌和人類的健康,在美國(guó)醫(yī)院抗萬古霉素腸道球菌（VRE）是廣泛存在的。在美國(guó)VRE的血液感染的發(fā)病率從1989年得0.4％升至1999年的25.2％，隨之而來的是是腸球菌株中的VRE的快速增長(zhǎng)（60%屎腸球菌比2%的糞腸球菌）。人們普遍認(rèn)為，在美國(guó)VRE的出現(xiàn)是由于在醫(yī)院使用抗生素的結(jié)果。 在歐洲各國(guó)之間VRE的患病率差異很大，似乎在意大利和英國(guó)的最高

18、。在歐洲不同的國(guó)家，來自于各種動(dòng)物源的VRE的分離菌株已經(jīng)收回。它可在動(dòng)物和人類之間發(fā)生基因轉(zhuǎn)移（通過食物鏈污染）。這種聯(lián)系進(jìn)一步支持了在從人類和非人類中分離的VRE菌株中難分辨的vanA基因簇中基因型的存在，且在歐盟取締了阿伏霉素的使用之后VRE的定植率在不斷下降。,,,4. 腸球菌和人類的健康,一些研究試圖去比較根據(jù)人類，動(dòng)物或食物來源不同的腸球菌的耐藥譜。對(duì)抗生素有抗藥性的腸球菌是從食物中分離出來的，只有少數(shù)的對(duì)于臨床上的重

19、要抗生素（包括有氨芐青霉素，青霉素，慶大霉素，萬古霉素）有抗藥性。至于其他抗菌化合物，其中乳制品中的抗生素耐藥性菌株稍微的有點(diǎn)研究，往往都是因地區(qū)的不同或是不同的分離方法而又有很大的變化。牛奶中的重要的糞腸球菌對(duì)于氯霉素，四環(huán)素，紅霉素的抗藥性分別是64％，45％和32％。,,,,,4. 腸球菌和人類的健康,耐抗生素腸球菌的頻繁檢出可能與抗性基因的高效傳遞有關(guān)，這種傳遞則依靠結(jié)合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的傳遞達(dá)成。例如，在食物中分離的腸球

20、菌菌株四環(huán)素抗性（Tetr）是最常見的抗生素耐藥性的形式之一。2004年Huys研究表明在食物腸球菌中的四環(huán)素抗性主要是由同一類型四環(huán)素基因賦予的[tetM，tetL和tetS]，這與以前在獸醫(yī)學(xué)和臨床分離的腸球菌菌株的發(fā)現(xiàn)是一樣的。他們還發(fā)現(xiàn)四環(huán)素抗性菌株所表現(xiàn)出的重要的部分是共同抵抗紅霉素和氯霉素，這表明四環(huán)素抗性基因的選擇可以為進(jìn)一步的多抗的選擇提供一個(gè)合適的分子基礎(chǔ)。這可能是因?yàn)樗沫h(huán)素抗性基因與帶有多個(gè)抗生素耐藥性的轉(zhuǎn)座子有

21、聯(lián)系的原因。,,,,4. 腸球菌和人類的健康,在過去幾年中，一些研究報(bào)告說，在不同共軛模型發(fā)生抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移：i）在實(shí)驗(yàn)室條件下，在臨床，共生，食品和益生菌株之間；ii）在食物基質(zhì)；iii）在無菌小鼠中。最近，Mater利用宿主小鼠模型的研究顯示第一次在消化道腸球菌株植入到人的微生物菌群中發(fā)生了vanA基因簇的轉(zhuǎn)移。另一個(gè)嚴(yán)重問題是抗病基因轉(zhuǎn)移到更致病物種。Noble已經(jīng)證明了在小鼠皮膚模型中糞腸球菌可轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌，并

22、且在體外轉(zhuǎn)移到李斯特菌種也已經(jīng)報(bào)道。最近這種轉(zhuǎn)移與抗萬古霉素和抗青霉素的金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)有關(guān)系。由于這種病原菌的主要威脅，這種新的抗性類型必須仔細(xì)的檢測(cè)。,,,,,4. 腸球菌和人類的健康,4.3致病因子,大約有十幾個(gè)致病因素已經(jīng)在各種動(dòng)物模型中通過毒力分析（表2）。他們附著在宿主細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(AS,Esp, EfaA)，在對(duì)抗巨噬細(xì)胞（AS,HypR），在細(xì)胞核組織損傷中(Cyl, GelE,SprE)和在逃避免疫

23、系統(tǒng)時(shí)。,,,4. 腸球菌和人類的健康,表2 糞腸球菌毒性相關(guān)基因和其假定的功能,a 未確定的b作為調(diào)節(jié)器，他們可能會(huì)有多效性,4. 腸球菌和人類的健康,這些致病因素被編碼通過接合質(zhì)粒基因(AS和Cyl)或染色體區(qū)域重新排列。i）fsr位點(diǎn) (GelE, SprE和Fsr)，ii）被描述為致病島大的染色體區(qū)域(Esp, Cyl, AS 和Gls24-like,iii）cps位點(diǎn)。質(zhì)粒編碼的毒力因素被證明是通過基因轉(zhuǎn)移機(jī)制而具有的傳

24、染性。最近，從糞腸球菌V583的基因組序列和在應(yīng)變MMH594中的致病島中鑒別出一組與糞腸球菌毒力有關(guān)的基因。他們?cè)谡掣剿睾颓忠u素、胞外酶、蛋白酶和表面細(xì)胞外的蛋白質(zhì)。至于屎腸球菌，只有兩個(gè)假定的致病基因已被確定，它們編碼腸球菌表面蛋白（espefm）和一個(gè)假定的透明質(zhì)酸酶（hyl）,,,,4. 腸球菌和人類的健康,然而，屎腸球菌基因組可能顯示了額外的假定的如一些特異性的致病因子，迄今為止，在屎腸球菌基因組草案中已檢測(cè)到不超過40

25、%的糞腸球菌蛋白。據(jù)我們所知，還沒有在其他腸球菌種中發(fā)現(xiàn)毒力因子。雖然糞腸球菌和屎腸球菌假定的致病因素在臨床菌株中發(fā)生率較高，但是它們也被發(fā)現(xiàn)在食品相關(guān)菌株中。,,,4. 腸球菌和人類的健康,在乳制品和臨床的堅(jiān)忍腸球菌和小腸腸球菌分離的Esp,AS和GelE編碼基因的檢測(cè)結(jié)果都表明在腸球菌種屬里，糞腸球菌毒力是決定因素且是普遍存在的。到目前為止，上述致病因素都沒有被發(fā)現(xiàn)在臨床菌株中普遍存在，因此盡管這些因素可能并不是糞腸球菌致病

26、性必不可少的，但是它們?nèi)匀豢赡苡绊懠膊〉膰?yán)重程度，同樣建議對(duì)致病突變體進(jìn)行動(dòng)物模型研究。,在決定這些因素所扮演的角色所遇到的困難是由于所依賴的動(dòng)物模型不同而不同的結(jié)果，特別是對(duì)聚合物質(zhì)，這樣的話，當(dāng)評(píng)估腸球菌致病性時(shí)采用哪一種模型就是一個(gè)問題。雖然毒力基因檢測(cè)可能指向食品潛在的毒力，但是食源性腸球菌的感染還從未報(bào)道。,,,,4. 腸球菌和人類的健康,此外，毒力基因的存在并不意味著他們的功能。事實(shí)上，各種攜帶gelE的分離株都沒有能夠合

27、成明膠酶。然而，食品菌株可能通過水平轉(zhuǎn)移引起致病基因傳播而不是直接引起感染。在對(duì)其他條件致病菌研究的基礎(chǔ)上，腸球菌毒力因子的表達(dá)可能將會(huì)隨著生態(tài)位而變化，導(dǎo)致潛在毒性增加，尤其是對(duì)老年人和免疫力功能低下患者。目前，還沒有腸球菌毒力模型能夠充分模擬其特殊的病理生理學(xué)條件來明確區(qū)分致病性和非致病性菌株。然而，對(duì)于抗生素耐藥性和毒力性狀的篩選，應(yīng)有助于減少腸球菌的傳播。,,,,,5. 結(jié)論和觀點(diǎn),腸球菌一直用在眾多的發(fā)酵乳制品中

28、，但在發(fā)酵過程中的應(yīng)用仍有爭(zhēng)論。的確，能快速獲得耐藥性的腸球菌主要?dú)w因于他們作為醫(yī)院病原體的出現(xiàn)，從而又增加了如何處理食源性腸球菌的問題。雖然，通過分子型方法難以鑒別來自臨床型和食物菌株，攝入食物中包含的腸球菌與傳染之間的有無相關(guān)性也尚未被證實(shí)。此外，似乎在奶酪中的腸球菌仍然對(duì)大多數(shù)抗生素敏感，如慶大霉素和萬古霉素。正如Lopes Silva 所報(bào)道的：“文獻(xiàn)中的腸球菌的耐藥性往往是限于臨床腸球菌，并且臨床腸球菌菌株的特征常常與腸球

29、菌菌株的一般特征相混淆。不過，乳制品構(gòu)成腸球菌的容器，并且因此形成抗生素耐藥性和毒力基因的潛在容器，這些都可能在胃腸道轉(zhuǎn)移到人類的菌株上。,,,,5. 結(jié)論和觀點(diǎn),因此，未來的食品安全方面應(yīng)該包括對(duì)從食物腸球菌到人類腸球菌的抗生素耐藥性的轉(zhuǎn)移和其他病原體的仔細(xì)檢查。還應(yīng)通過在獸醫(yī)中減少使用抗生素和在人類醫(yī)學(xué)中更謹(jǐn)慎地使用抗生素來努力集中消滅食品中的耐抗生素的腸球菌。,對(duì)于食物菌株和啟動(dòng)器一個(gè)一個(gè)逐案分析是有必要的。進(jìn)一步的提高我們對(duì)腸