表面蛋白EF3183對(duì)致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11部分生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、腸球菌雖然是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的重要組成部分，但在醫(yī)學(xué)臨床和獸醫(yī)臨床完全證實(shí)具有致病性。腸球菌廣泛的致病性除了與其獨(dú)特的耐藥性有關(guān)外，眾多的毒力因子也發(fā)揮著重要作用。在眾多毒力因子中其一系列的表面蛋白在細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附、定殖以及致病性方面發(fā)揮著重要作用。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,以致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11為親本株，應(yīng)用同源重組的方法構(gòu)建新篩選出的表面蛋白EF3183基因突變株，培養(yǎng)HeLa及RAW264.7細(xì)胞，通過觀察突變株對(duì)

2、HeLa細(xì)胞的粘附能力和EF3183單抗的粘附抑制、小鼠RAW264.7細(xì)胞的侵染能力、小鼠主要臟器的載菌能力以及對(duì)BF形成能力的影響。來闡述新篩選的表面蛋白EF3183在XJ11株致病過程中的作用，為進(jìn)一步闡明糞腸球菌的致病機(jī)理提供有用數(shù)據(jù)。現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下：
　　1、致羔羊腦炎糞腸球菌表面蛋白基因的檢測(cè)：根據(jù)致羔羊腦炎糞腸球菌XJ05全基因組測(cè)序的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)表面蛋白EF1092、EF1269、

3、EF2224、EF2505、EF3183在11株致羔羊腦炎糞腸球菌中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種表面蛋白在11株致羔羊腦炎糞腸球菌中廣泛分布，除XJ09只含有EF2224外，其余10株菌中均含有五種表面蛋白。
　　2、致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11株EF3183基因的克隆與生物信息學(xué)分析：采用PCR方法擴(kuò)增EF3183基因，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)期功能，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，成功獲得了長(zhǎng)1060 bp的表面蛋白EF

4、3183基因；經(jīng)生物信息學(xué)分析，此序列包含有一個(gè)1056 bp的完整開放閱讀框，編碼351個(gè)氨基酸；無信號(hào)肽；有2個(gè)跨膜區(qū)；抗原表位預(yù)測(cè)顯示表面蛋白EF3183有15個(gè)抗原表位；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因與糞腸球菌v583的EF3183基因的進(jìn)化距離最近。
　　3、致羔羊腦炎糞腸球菌XJ11-Δ3183突變株的構(gòu)建：應(yīng)用同源重組技術(shù)構(gòu)建XJ11的EF3183基因突變株，使用Primer5

5、設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出用于失活表面蛋白EF3183基因的插入序列，酶切、回收該基因序列，并與酶切后的穿梭質(zhì)粒進(jìn)行連接后，電轉(zhuǎn)化至E. faecalis XJ11的感受態(tài)細(xì)胞中。使用卡那霉素抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，并采用PCR等方法進(jìn)行鑒定。最終成功得到基因突變株E. faecalis XJ11-Δ3183。
　　4、E. faecalis XJ11-Δ3183在細(xì)胞粘附、特異性單抗粘附抑制、侵染及臟器載菌量研究：以E. faecalis

6、XJ11為對(duì)照組，E. faecalis XJ11-Δ3183為實(shí)驗(yàn)組，分別于粘附HeLa細(xì)胞1 h和2 h后裂解細(xì)胞，在E. faecalis XJ11粘附HeLa細(xì)胞前加入抗表面蛋白EF3183的單克隆抗體，裂解細(xì)胞涂平板后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；于細(xì)菌侵染小鼠RAW264.7細(xì)胞4 h和24 h后，裂解細(xì)胞，涂平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；在不同時(shí)間人工感染小鼠，取肝小葉、脾臟、左腎和心臟組織勻漿，勻漿液稀釋后涂平板統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)計(jì)算小鼠臟器載菌量。結(jié)果顯

7、示與野毒株比較，EF3183突變株的對(duì)HeLa細(xì)胞粘附數(shù)量明顯下降，且差異極顯著（P<0.001）。加入單抗的E. faecalis XJ11對(duì)HeLa細(xì)胞粘附數(shù)量明顯出現(xiàn)下降，且差異極顯著（P<0.001）。侵染小鼠RAW264.7細(xì)胞細(xì)菌數(shù)量變化不明顯，且差異不顯著（P>0.05）。感染小鼠6 h、12 h和24 h后，突變株在小鼠肝小葉、脾臟、左腎的載菌量下降明顯，且差異極顯著（P<0.01）；在心臟的載菌量下降明顯，且差異顯著（

8、P<0.05）。
　　5、E. faecalis XJ11-Δ3183生物被膜形成能力的研究：將E. faecalis XJ11和E. faecalis XJ11-Δ3183在分別置于37℃條件下于96孔板中培養(yǎng)8 h、18 h、24 h、36 h和48 h，經(jīng)1％結(jié)晶紫染色后，測(cè)定各個(gè)孔的吸光度。同時(shí)用孔底放有蓋玻片的六孔板培養(yǎng)細(xì)菌，經(jīng)刀豆蛋白A或PI染色后，將蓋玻片取出后用激光共聚焦顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示E.