雞補(bǔ)體C3部分生物學(xué)特性的研究.pdf

1、補(bǔ)體是動(dòng)物體液中重要的免疫物質(zhì)，由40多種蛋白質(zhì)組成，廣泛存在于血清、組織液和細(xì)胞膜表面，是具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)，其活化過(guò)程表現(xiàn)為一系列絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)酶解反應(yīng)。多種微生物成分、抗原-抗體復(fù)合物以及其他外源性和內(nèi)源性的物質(zhì)可通過(guò)3條途徑(經(jīng)典激活途徑、旁路激活和途徑MBL激活途徑)激活補(bǔ)體，這3條途徑以裂解C3形成C3b相互交叉，由C3b形成不同的C5轉(zhuǎn)化酶(C4b2a3b、C3bBb)，激活補(bǔ)體C5開(kāi)始共同的終末反應(yīng)過(guò)程

2、，最后形成膜攻擊復(fù)合物(MAC)插入靶細(xì)胞，通過(guò)破壞靶細(xì)胞局部磷脂雙層而形成滲漏斑，或形成穿膜的親水性孔道，導(dǎo)致靶細(xì)胞崩解?？梢?jiàn)補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵分子。在以上理論的指導(dǎo)下，本課題對(duì)雞補(bǔ)體C3的主要生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，探明了雞體內(nèi)補(bǔ)體C3的分子量、含量以及C3的作用、作用原理進(jìn)行了研究. 1.探明了雞與哺乳動(dòng)物對(duì)細(xì)菌性疫苗免疫效果不同的原因。在實(shí)驗(yàn)中，將078大腸桿菌活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，以甲醛滅活，蜂膠為佐劑制備大

3、腸桿菌顆粒性疫苗，免疫11日齡海藍(lán)褐蛋用公雛，制備大腸桿菌抗血清；將大腸桿菌抗血清中的補(bǔ)體滅活，使之與已定數(shù)量的大腸桿菌反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，然后加入不同動(dòng)物的新鮮血清，通過(guò)細(xì)菌計(jì)數(shù)，觀察不同動(dòng)物血清補(bǔ)體對(duì)大腸桿菌的清除能力；建立了微量血凝法測(cè)定動(dòng)物血清補(bǔ)體效價(jià)，并對(duì)雞和幾種哺乳動(dòng)物新鮮血清中的補(bǔ)體總活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，單純抗體與活菌結(jié)合后，對(duì)細(xì)菌的清除作用影響微弱，而加入補(bǔ)體后，抗體殺滅細(xì)菌的能力明顯增強(qiáng)；經(jīng)比較，哺乳動(dòng)物血清

4、中的補(bǔ)體對(duì)細(xì)菌的清除能力明顯高于雞；而豚鼠的補(bǔ)體的殺菌能力又明顯高于其他哺乳動(dòng)物；對(duì)不同動(dòng)物血清補(bǔ)體總活性的測(cè)定結(jié)果表明，成年SPF雞的補(bǔ)體總活性為25，低于兔、豬、牛、羊、豚鼠等哺乳動(dòng)物，在這幾種哺乳動(dòng)物中，豚鼠的血清補(bǔ)體總活性為28。由此證明：不同動(dòng)物體內(nèi)補(bǔ)體活性的差異是哺乳動(dòng)物和雞對(duì)細(xì)菌性疫苗免疫效果不同的原因。 2.抗雞補(bǔ)體C3IgG的制備。按照雞補(bǔ)體C3的α鏈上羧基端第1272位到1292位的21個(gè)氨基酸殘基序列人工合

5、成模擬C3分子的21肽，以戊二醛作為交聯(lián)劑，與牛血清白蛋白載體偶聯(lián)結(jié)合，制成人工合成抗原復(fù)合物。將此人工合成抗原與弗氏佐劑混合乳化成油乳劑疫苗免疫注射家兔，制備成抗21肽血清，并用硫酸銨沉淀法提取抗血清中的IgG；采用間接ELISA方法測(cè)定抗21肽血清和IgG的抗體效價(jià)。結(jié)果表明，人工合成的C3分子的21肽復(fù)合抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，制成的抗血清中的抗體效價(jià)達(dá)210，從抗血清中提取的IgG的抗體效價(jià)達(dá)215。 3.不同動(dòng)物體內(nèi)補(bǔ)

6、體C3的含量的測(cè)定。利用純化的抗21肽IgG，以間接ELISA方法測(cè)定雞和幾種哺乳動(dòng)物體內(nèi)補(bǔ)體C3的含量，結(jié)果表明，雞、豬、山羊、牛、豚鼠五種動(dòng)物血清中的補(bǔ)體C3含量分別為0.34±0.005mg/ml、1.47±0.008mg/ml、1.70±0.005mg/ml、1.78±0.007mg/ml和4.18±0.008mg/ml。以上結(jié)果顯示，雞體內(nèi)的C3含量明顯低于其他幾種動(dòng)物，差異極顯著(p＜0.01)。 4.抗雞補(bǔ)體C3b

7、IgG的制備。利用菊糖能夠從旁路途徑激活補(bǔ)體的特性，使菊糖與新鮮雞血清反應(yīng)，補(bǔ)體激活過(guò)程中生成的補(bǔ)體C3b分子通過(guò)共價(jià)鍵與菊糖分子形成菊糖-C3b，分離反應(yīng)液中的菊糖-C3b，用于免疫注射家兔制備抗雞補(bǔ)體C3b血清，并利用ProteinA-SepharoseCL-4B作為層析介質(zhì)，以親和層析方法從抗C3b血清中分離純化抗C3bIgG。應(yīng)用間接ELISA方法測(cè)定抗C3b血清和IgG的抗體效價(jià)。結(jié)果表明，制成的抗血清中的抗體ELISA效價(jià)達(dá)

8、212，從抗血清中提取的IgG的抗體效價(jià)達(dá)218。 5.雞補(bǔ)體C3b的分離純化。按照說(shuō)明書(shū)，將純化的抗C3bIgG連接于CNBr-activatedsepharose4BFastFlow的活化位點(diǎn)上，制備以抗C3bIgG為配體的親和層析柱，用活化SPF雞血清重復(fù)過(guò)層析柱，以0.1mol/L氨基乙酸-HCl緩沖液(PH2.8)洗脫，ELISA檢測(cè)洗脫液中含有C3b的組分，將分離到的C3b經(jīng)非變性的PAGE電泳檢測(cè)，得到單一條帶的電

9、泳圖譜，經(jīng)變性的PAGE-SDS電泳檢測(cè)，電泳圖譜上顯示兩條蛋白帶，分別為C3b的α鏈β鏈，表明分離到了純度較高的補(bǔ)體C3b蛋白。 6.雞補(bǔ)體C3b對(duì)免疫增強(qiáng)作用的驗(yàn)證。以戊二醛作為交聯(lián)劑，將分離到的C3b蛋白與大腸桿菌抗原偶聯(lián)，制備成大腸桿菌-C3b抗原復(fù)合物；免疫注射SPF雞，對(duì)照組雞免疫注射弗氏完全佐劑大腸桿菌疫苗。分別在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血，用ELISA方法測(cè)定血清中的抗體含量，同時(shí)測(cè)定血清中總

10、補(bǔ)體活性。結(jié)果表明，免疫后3周，弗氏佐劑大腸桿菌疫苗誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生的抗體效價(jià)高于C3佐劑疫苗組，但至第4周，弗氏佐劑疫苗組的抗體水平達(dá)到高峰(OD值=0.270±0.004)，然后迅速下降，到第九周降至0.200±0.005，而C3疫苗組雞免疫后的抗體水平持續(xù)上升，從免疫后第二周的0.098±0.003上升到第八周的0.275±0.002。證明C3能夠促進(jìn)免疫記憶細(xì)胞的產(chǎn)生，并能夠使細(xì)菌抗原給予免疫細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定的刺激，從而使雞體維持高水平