腸球菌性羔羊腦炎的發(fā)現(xiàn)及其病原特性和診斷方法研究.pdf

1、腸球菌是動(dòng)物和人類正常菌群的重要組成部分，多作為有益菌進(jìn)行研究。然而有研究表明，在需氧革蘭陽性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要院內(nèi)感染致病菌。美國醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)(NISS)已將其列為引起醫(yī)院感染的第二大病原菌。最近幾年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)部分規(guī)模化羊場連續(xù)在同一季節(jié)發(fā)生一種以20-40日齡羔羊神經(jīng)癥狀和敗血癥為主要癥狀和病變特征的傳染性疾病，羔羊的病死率高達(dá)20％左右，經(jīng)病原分離鑒定和回歸試驗(yàn)確診為腸球菌所致羔羊腦炎，這是羔羊的一種新的疾

2、病，本文圍繞該病的病原特性和診斷方法開展了系列研究，以期為闡明腸球菌對(duì)羔羊的致病機(jī)理和有效防治該病提供科學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)果如下： 1．腸球菌性羔羊腦炎的發(fā)現(xiàn)及其病原分離鑒定：自2002年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)部分規(guī)?；驁鲞B續(xù)幾年在冬季產(chǎn)羔季節(jié)發(fā)生了一種病程很短，無品種差異，主要感染羔羊、可引起死亡的、以敗血癥和神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染病。先后從不同羊場發(fā)生腦炎癥狀的羔羊體內(nèi)分離到11株細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、血清學(xué)以及動(dòng)物試驗(yàn)

3、確定是由腸球菌屬的某些種引起。 2．檢測羔羊腸球菌性腦炎間接ELISA方法建立和初步應(yīng)用：利用超聲波裂解制備致羔羊腦炎糞腸球菌裂解物作為抗原包被酶標(biāo)板，應(yīng)用棋盤滴定法，通過條件篩選成功建立了致羔羊腸球菌抗體測定的間接ELISA方法。應(yīng)用該方法檢測羔羊腸球菌陽性血清，其靈敏度是微量凝集反應(yīng)的25-100倍。利用建立的方法檢測來自未免疫羊場的50份成年羊血清和30份羔羊血清，結(jié)果顯示有2份成年羊血清呈陽性。 3．檢測羔羊腸球

4、菌性腦炎PCR方法建立和初步應(yīng)用：以致羔羊腦炎糞腸球菌基因組為模板，以相對(duì)保守的腸球菌的tuf基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過條件篩選成功的建立了用于致羔羊腦炎腸球菌快速診斷的PCR方法，其靈敏度在10fg。應(yīng)用該方法檢測自然感染羔羊和人工感染發(fā)病死亡羔羊以及人工感染發(fā)病死亡小鼠主要器官組織，即在心、肝、脾、腎、腦、腦脊液等組織中均檢測到了腸球菌DNA，其中2只人工感染死亡羔羊還在肺門淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中檢測到腸球菌DNA。 4.

5、免疫組化檢測羔羊糞腸球菌性腦炎及其抗原定位的研究：以導(dǎo)致羔羊腦炎的糞腸球菌為研究對(duì)象，人工感染小鼠，通過條件優(yōu)化，建AT腸球菌性羔羊腦炎檢測的間接免疫組化方法。用該方法定期檢測糞腸球菌在試驗(yàn)小鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果顯示：4h時(shí)可在小鼠的肝臟中檢測到糞腸球菌的陽性顆粒；14h時(shí)在腎臟和心臟中檢測到陽性顆粒；18h可在食道中檢測到糞腸球菌陽性顆粒；20h在腦中檢測到陽性顆粒；22h在肺臟和氣管中檢測到糞腸球菌陽性顆粒；24h可在除脾臟外所有受檢

6、組織即腦、肝、心臟、腎、氣管、肺、食道及小腸中觀察到糞腸球菌的陽性顆粒。 5.致羔羊腦炎腸球菌毒力因子的分子流行病學(xué)調(diào)查：對(duì)11株致羔羊腦炎腸球菌ace、efa、cylA、gelE、asal和asa373、esp、EF0591和EF3314等9種毒力因子基因的PCR檢測結(jié)果表明，5/11株腸球菌檢測到esp、cylA、asal、ace、efa、EF0591和EF3314等7種毒力因子基因。1/11株檢測到esp、gelE、asa

7、l、ace、efa和EF3314等6種毒力因子基因，1/11株檢測到cylA、asal、ace、efa、EF0591和EF3314等6種毒力因子基因，1/11株檢測到esp、cylA、asal、ace、EF0591和EF3314。1/11株菌僅攜帶esp基因。2/11株菌未檢測上述9種毒力因子基因任何一種。與人類醫(yī)學(xué)其它來源腸球菌毒力因子攜帶情況不同。 6.致羔羊腦炎糞腸球菌8種毒力因子基因片段克隆和序列特征研究：將致羔羊腦炎糞

8、腸球菌檢測到的的8個(gè)毒力因子ace、efa、cylA、gelE、asal、esp、EF3314和EF0591基因部分片段克隆到pMD19-T載體上，應(yīng)用PCR及酶切方法檢測出陽性克隆并進(jìn)行序列測定。通過BLAST軟件對(duì)致羔羊腦炎糞腸球菌各毒力基因擴(kuò)增片段的測定序列與GeneBank公布的醫(yī)學(xué)臨床分離株相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析比較，結(jié)果顯示兩種來源8種毒力因子基因目的片段序列的同源性分別為99.3％、99.56％、99.3％、97.85％、

9、96.64％、99.9％、99.29％和98.11％。 7.致羔羊腦炎腸球菌與臨床健康羔羊分離的腸球菌生物學(xué)特性的比較研究：通過研究發(fā)現(xiàn)羔羊兩種來源腸球菌的培養(yǎng)特性和生化特性基本一致；對(duì)某些抗生素有不同程度的耐藥性；致病株有更多的毒力因子組合；對(duì)兩者共有的毒力因子基N JCN進(jìn)行克隆與序列分析，并同時(shí)與GeneBank來自醫(yī)學(xué)臨床分離株相應(yīng)毒力因子基因片段比對(duì)分析，其同源性很高，均在95％以上。正常菌群株不能引起小鼠的死亡，而致

10、病株可導(dǎo)致小鼠的死亡。 8.致羔羊腦炎糞腸球菌在人工感染小鼠疾病模型體內(nèi)分布規(guī)律及病理學(xué)研究：經(jīng)不同途徑用致羔羊腦炎糞腸球菌分離株感染小鼠，最佳途徑是腹腔注射，皮下注射次之，鼻腔吸入不引起感染。對(duì)小鼠的LD<,50>為9.3×10<'10>CFU。定期剖殺腹腔接種致羔羊腦炎糞腸球菌的小白鼠，用2種不同的方法檢測在細(xì)菌主要臟器中的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染2h后用PCR方法即可從腦、肝和心血檢測到糞腸球菌DNA。6h后不僅能檢測到腸球菌：