日本腦炎病原檢測與免疫防治方法的研究.pdf

1、日本腦炎（Japanese encephal itis，JE）是由日本腦炎病毒（JapaneseEncephal itis Virus，JEV）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病。本病在世界許多國家廣泛存在，不但對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且嚴重威脅著人類的健康。JE的診斷可以通過臨床檢測結(jié)合流行病學進行，確診需要實驗室血清學檢測和病原學檢測。目前，乙腦的治療沒有有效的方法，只有進行疫苗接種結(jié)合滅蚊工作進行.本實驗從乙腦的檢測和防治方面

2、做了以下研究。
　　 一、日本腦炎病毒SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用
　　 本實驗分別以JEV保守的prM，NS1及E基因片段為模板設計三對引物，篩選基于SYBR GreenⅠ模式的實時熒光PCR的最佳引物，以建立快速、準確檢測日本腦炎病毒的實時熒光PCR方法。以測序正確的陽性質(zhì)粒為標準品建立標準曲線，并方法的敏感性、特異性、可重復性進行評價。結(jié)果表明，以E蛋白核苷酸序列957-1431b

3、p區(qū)域作為模板設計的引物，靈敏度較其他兩個高，該方法只從JEV陽性樣本檢出擴增信號，不與其它病原出現(xiàn)交叉反應；熔解溫度為86.2±0.5℃，擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個單特異峰，無引物二聚體；在1×103～1×109拷貝之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，擴增效率94.2％，最低可檢測1000拷貝以下反應陽性標準品，比常規(guī)PCR敏感至少103倍；組內(nèi)變異系數(shù)、組間變異系數(shù)分別為0.53％-1.42％、1.16％。對16例豬

4、乙腦臨床疑似病料進行檢測，陽性率為81.25％（13/16），陽性樣品擴增片段大小為475bp，與預期大小相當。本研究建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR特異性強、靈敏度高、檢測迅速，為JEV的快速檢測、分子流行病學調(diào)查提供新方法。
　　 二、一株豬源日本腦炎滅活疫苗配伍不同的佐劑在小鼠體內(nèi)的免疫特性研究
　　 為了評價發(fā)展一種有效的由Vero細胞增殖的豬源日本腦炎疫苗，本研究以一株從蚊體中分離得到的豬源日本腦炎病

5、毒NJ2008株作為滅活疫苗研究用種毒，經(jīng)BHK細胞增殖后病毒效價可達108.67TCID50/mL。將病毒接種于長滿Vero細胞的轉(zhuǎn)瓶上培養(yǎng)，收集病毒液，經(jīng)純化、濃縮后以0.2％的福爾馬林滅活，病毒經(jīng)福爾馬林滅活后分別與Montanide ISA15AVG白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏不完全佐劑（FIA）和蜂膠佐劑配伍制成滅活疫苗。4～6周齡的BALB/c小鼠（均為雌性），隨機分為6組，每組12只，前四組進行不同佐劑的滅活疫苗的免疫，第五、