日本腦炎病毒多表位基因與法氏囊活性肽的串聯(lián)表達及其免疫特性研究.pdf

1、日本腦炎（JapaneseEncephalitis，JE），又稱流行性乙型腦炎(EpidemicEncephalitisB)，是由日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus，JEV)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病。豬作為日本腦炎傳播的中間擴增宿主，帶毒蚊子通過叮咬將感染性病毒傳播給人。該病在我國流行面積較大，對養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大，近年來經(jīng)濟損失較為嚴重，因此預(yù)防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。目前對乙型

2、腦炎的治療仍然沒有行之有效的方法，而且對待本病主要還是以免疫接種疫苗的方式進行預(yù)防。尋求穩(wěn)定、安全的豬用乙腦疫苗，已經(jīng)成為近年JEV感染防治的主要研究方向。
　　 目前關(guān)于表位疫苗的設(shè)計策略取得了較大的研究進展，作為理想的免疫原，抗原分子中應(yīng)同時包含目的抗原B細胞表位和自身或外源T細胞表位，才能誘導(dǎo)出高特異性的細胞及體液免疫應(yīng)答，從細胞免疫和體液免疫水平起到預(yù)防或治療作用，賦予較廣泛的保護性。因此表位疫苗成為近年來病毒新型疫苗研

3、究的熱點。
　　 法氏囊(bursaofFabricus，BF)是禽類獨有的中樞免疫器官，其功能與哺乳動物中的骨髓類似。三肽囊素作為BF組織中分離的活性分子，無種屬特異性，不僅對禽類具有免疫調(diào)節(jié)功能，而且對哺乳動物及人類淋巴細胞也具有明顯的免疫學及生理學活性。法氏囊五肽為BF組織中分離的又一活性分子，對禽類具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 本研究利用基因重組技術(shù)，把日本腦炎病毒E蛋白上的多表位基因(MEP)、囊素樣肽基因和

4、法氏囊五肽基因分別串聯(lián)起來，構(gòu)建三種原核表達載體，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達。表達的融合蛋白純化后免疫小鼠，研究三者的免疫原性及保護效力，希望為研制具有高免疫原性的改良的乙腦表位疫苗提供依據(jù)。具體的研究內(nèi)容如下:
　　 1串聯(lián)表達JEVE蛋白多表位基因、囊素樣肽及法氏囊五肽
　　 利用PCR擴增出含日本腦炎病毒(JEV)E蛋白6個B細胞表位（氨基酸殘基分別位于75-92，149-163，258-285，356-362，37

5、3-399，397-403），2個T細胞表位的基因（氨基酸殘基分別位于60-68和436-445），即JEVE蛋白多表位基因(MEP)，用EcoRI和Xho(I)雙酶切將其連接到pET-28a(+)載體中，構(gòu)建含MEP基因的重組原核表達載體。由于囊素樣肽（Bursin-likepeptide，BSA）能增強乙腦亞單位疫苗的免疫反應(yīng)，在本研究中還構(gòu)建了一個在大腸桿菌中表達的重組載體，將JEVE蛋白多表位基因(MEP)按正確的讀碼框與囊素樣

6、肽基因串聯(lián)，構(gòu)建含MEP-BSA基因的重組原核表達載體。此外，法氏囊五肽（Bursopentine，BP5）為本組從雞法氏囊中新分離的一種活性肽，為了弄清其免疫佐劑效應(yīng)，本研究將JEVE蛋白多表位基因(MEP)、囊素樣肽基因按正確的讀碼框與法氏囊五肽基因串聯(lián)，構(gòu)建另一個融合表達載體pET-MEP-BSA-BP5。將三種重組表達載體在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達，以His·Bind螯合層析柱純化三種融合蛋白（rMEP、rMEP-BSA、rM

7、EP-BSA-BP5），然后運用SDS-PAGE進行可溶性分析，利用WesternBlotting對該融合蛋白進行了鑒定。結(jié)果表明:三種融合蛋白均以包涵體的形式獲得了高效表達。通過His·Bind螯合層析柱純化后的三種融合蛋白，通過WesternBlotting鑒定其具有良好的抗原性。
　　 2重組蛋白rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5對小鼠特異性免疫的影響
　　 4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成

8、5組，每組10只。將50μg的rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三種融合蛋白（用100μlPBS稀釋）分別以肌肉注射接種的方式給小鼠進行3次免疫，同時設(shè)兩組對照組小鼠，分別是PBS和JEV弱毒疫苗（SA-14-14-2病毒株）。通過檢測中和抗體、抗體亞型（IgG1和IgG2a）、淋巴細胞增殖、INF-γ和IL-4細胞因子的表達水平、T細胞亞型、攻毒實驗發(fā)現(xiàn)，使用rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三種融

9、合蛋白都能明顯的提高小鼠的特異性免疫反應(yīng)。IgG1和細胞因子IL-4水平表明rMEP蛋白主要刺激Th2型免疫反應(yīng)。而rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5蛋白既能刺激Th2型免疫反應(yīng)，也能刺激Th1型免疫反應(yīng)。然而，Th1型免疫反應(yīng)明顯低于JEV弱毒疫苗但高于rMep蛋白，rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5兩個蛋白產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很相似。攻毒實驗結(jié)果表明rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5與弱毒苗一樣都能保護小