油松毛蟲和日本龜蠟蚧對病原菌入侵的免疫反應(yīng)研究.pdf

1、油松毛蟲(Dendrolimus fabulaeformis Tsai et Liu)和日本龜蠟蚧(Ceroplastesjaponicus Green)是農(nóng)林業(yè)的重大害蟲，傳統(tǒng)的化學(xué)防治手段存在農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染，殺傷天敵和害蟲產(chǎn)生抗藥性等問題。采用病原菌進行生物防治具有沒有污染、防治靶標害蟲專一性強和致死效果好等優(yōu)點，然而病原菌在侵染昆蟲的過程中會受到昆蟲免疫系統(tǒng)的抵抗，因此，研究昆蟲感染病原菌后的免疫反應(yīng)能對應(yīng)用病原菌防治害蟲提供

2、理論依據(jù)。本論文研究了油松毛蟲和日本龜蠟蚧受病原菌入侵后的免疫反應(yīng)，其內(nèi)容包括兩部分。
　　1.油松毛蟲抗菌物質(zhì)及其抗菌活性的研究采用體內(nèi)注射法，對油松毛蟲Dendrolimus tabulaeformis3齡幼蟲注射濃度為1.0×108個/mL的大腸桿菌Escherichia coli菌懸液，使其誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，12h后收集制備血淋巴粗提液。分別測定對4種細菌和4種真菌的抗菌活性，并檢測溫度、pH值變化和反復(fù)凍融對抗菌活性的影

3、響。采用Tricine-SDS-PAGE電泳法確定抗菌物質(zhì)的分子量大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的油松毛蟲3齡幼蟲血淋巴粗提液對試驗的細菌和真菌均有不同程度的抑制作用，其中對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌(Escherichicha coli)和變形桿菌(Proteus species)的抑制作用強于革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。血淋巴粗提液的的抗菌活性在

4、50℃水浴和pH值在4-9的條件下保持穩(wěn)定，反復(fù)凍融1-5次其抗菌物質(zhì)的活性僅降低4.3-14.9％。電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組血淋巴提粗液在23.2KDa和15.0KDa處分別出現(xiàn)一條特異性條帶，在60.4KDa處蛋白帶變淺。由此推測從油松毛蟲幼蟲體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可能是分子量為23.2KDa和15.0KDa的抗菌肽或者抗菌蛋白。
　　2.日本龜蠟蚧對蠟蚧輪枝菌感染的免疫反應(yīng)研究研究了蚧蟲病原真菌蠟蚧輪枝菌的生物學(xué)特性，結(jié)果表明溫

5、度和濕度對蠟蚧輪枝菌孢子的萌發(fā)，菌絲的生長和發(fā)育有明顯的影響。蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)、生長和產(chǎn)孢的適宜條件為:相對濕度95％、溫度為25℃。蠟蚧輪枝菌菌株菌絲生長的適溫范圍是20-30℃。產(chǎn)孢量為是4.31×106-4.57×108個/mL。
　　在溫度為25±1℃，相對濕度95±5％的條件下用不同濃度的孢子懸液感染日本龜蠟蚧，相同感染時間下，孢子濃度與蟲體死亡率呈正相關(guān)，侵染死亡率最高為91.2％。初步觀察了蠟蚧輪枝菌感染日本龜蠟蚧

6、的入侵特點以及日本龜蠟蚧染菌后的罹病癥狀，發(fā)現(xiàn)在陰門區(qū)菌絲較多，蟲體邊緣與蠟殼之間有分離的縫隙出現(xiàn)，內(nèi)部器官和組織嚴重萎縮、黑化，蠟殼顏色也呈現(xiàn)污濁狀。
　　采用分光光度法測定了日本龜蠟蚧被蠟蚧輪枝菌感染后保護酶和抗菌物質(zhì)的活性，結(jié)果表明:被蠟蚧輪枝菌感染后第1-8d，感染蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著高于未感染的蟲體，并呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢，而未感染蟲體的變化不大;過氧化氫酶(CAT)及多酚氧化酶(PPO)的活

7、性變化趨勢與SOD的相似。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析了日本龜蠟蚧感染蠟蚧輪枝菌后1-8d體內(nèi)SOD同工酶與CAT同工酶的變化，發(fā)現(xiàn)SOD和CAT同工酶帶寬與酶帶亮暗均變化顯著。
　　測定了日本龜蠟蚧被蠟蚧輪枝菌感染后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和血淋巴抗菌物質(zhì)的變化。結(jié)果表明:被蠟蚧輪枝菌感染后1-8d，蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)和含量逐漸減少，而未感染的則變化不大;染菌后第2d，日本龜蠟蚧血淋巴內(nèi)新產(chǎn)生了分子量為16.8KDa的蛋白質(zhì)，說明蠟蚧輪枝