糞腸球菌溶血素在大鼠糞腸球菌再感染根尖周炎中的作用.pdf

1、根尖周炎是一種口腔常見疾病,目前根管治療術是治療根尖周炎的首選有效方法。然而即使經(jīng)過完善的根管治療,卻仍然有失敗的病例,通常表現(xiàn)為根尖區(qū)進行性溶骨破壞和復發(fā)性根尖周膿腫,最終形成難治性根尖周炎。研究發(fā)現(xiàn),導致這些現(xiàn)象的主要原因是根管內細菌的持續(xù)性感染。近年來發(fā)現(xiàn)在根管治療失敗病例中糞腸球菌具有高檢出率。
　　糞腸球菌擁有多種毒力因子,它們的表達可根據(jù)周圍環(huán)境因素的改變而進行調節(jié),這是糞腸球菌能夠在治療后根管內存活并致病的關鍵。溶血

2、素(cytolysin,Cyl)是糞腸球菌主要的毒力因子之一,雖然已證實它對其他糞腸球菌臨床感染疾病如心內膜炎、眼內炎等有很強的促炎作用,但是目前很少有關于其在難治性根尖周炎發(fā)病機理方面的報道。
　　溶血素基因cyl的表達受周圍環(huán)境影響較大,且影響其表達的因素眾多,已有報道當周圍氧濃度下降、血細胞存在、周圍細胞密度增加時均能上調它的表達水平。治療后根管內氧濃度下降;主要營養(yǎng)物質以根尖周組織提供的血清為主;細菌細胞密度大大降低。據(jù)此

3、推測,糞腸球菌進入根管后cyl可能受到這些因素的影響,進行表達的調節(jié),從而影響糞腸球菌在治療后根管內的存活和致病。
　　基于此,本研究在髓腔開放建立混合菌初次感染大鼠慢性根尖周炎模型的基礎上分別導入含有cyl基因的溶血型以及不含有cyl基因的非溶血型糞腸球菌標準菌株,從而構建溶血型及非溶血型糞腸球菌再感染大鼠根尖周炎模型,定期行組織病理學分析及各細胞因子表達量的檢測,比較溶血型與非溶血型糞腸球菌再感染大鼠根尖周炎的病程進展及炎癥反

4、應的差異,并結合溶血型糞腸球菌cyl基因在體外及體內各不同階段表達量變化的檢測結果,探索糞腸球菌Cyl在其再感染根尖周炎中的作用。本研究包括三部分實驗:
　　第一部分:溶血素對大鼠糞腸球菌再感染根尖周炎模型炎癥進展影響的組織病理學分析
　　方法:SD大鼠84只,雙側上頜第一磨牙開髓后建立混合菌(不含糞腸球菌)初次感染慢性根尖周炎模型后將大鼠分為四組:消毒組6只(根管預備、消毒后封FC棉球并繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周后取樣檢測);慢性根

5、尖周炎組6只(繼續(xù)正常飼養(yǎng)動物8周后取樣檢測);溶血型糞腸球菌再感染根尖周炎組36只、非溶血型糞腸球菌再感染根尖周炎組36只(經(jīng)根管預備消毒治療2周,在根管內分別注入溶血型糞腸球菌ATCC29212、非溶血型糞腸球菌ATCC700802菌懸液封閉后分別于1周、2周、3周、4周、5周及6周時取樣檢測)。每組每次隨機取樣6只,制作組織學切片,通過HE染色進行各檢測時間點的組織病理學分析。結果:消毒組根尖周病損愈合明顯。慢性根尖周炎組根尖周組

6、織呈輕度慢性炎癥,可見纖維細胞增生。兩組糞腸球菌在再感染1至3周時炎癥十分明顯,呈重度急性炎癥狀態(tài),并可見出血和骨質吸收現(xiàn)象,尤以2周時最甚。在4周時轉為慢性炎癥,從4周到6周根尖周炎癥逐漸減退,但仍見炎細胞浸潤。6周時非溶血型糞腸球菌再感染根尖周炎即轉為輕度慢性炎癥,但溶血型組炎癥程度仍較為嚴重。結論:溶血素雖不是炎癥進展的決定因素,但可降低糞腸球菌再感染根尖周炎炎癥的自愈性,延長炎癥進程。
　　第二部分:溶血素對大鼠糞腸球菌再

7、感染根尖周炎模型細胞因子表達的影響
　　方法:取樣及制作組織學切片方法同第一部分,在每個時間點均進行細胞因子TNF-α、IL-1β和MMP-8的免疫組化染色方法檢測,并分析比較兩組糞腸球菌再感染根尖周炎中各細胞因子表達量的差異。結果:兩組糞腸球菌再感染根尖周炎各細胞因子的表達量變化為:TNF-α表達量從1周上升至2周達高峰,后于3周至6周逐漸降低;IL-1β表達量從1周上升至3周達高峰,從4周至6周開始逐漸降低;MMP-8從1周開

8、始不斷上升至6周;三個細胞因子在消毒組表達量均最低。在各時間點溶血組中各細胞因子均較非溶血組表達量高,且兩組均強于慢性根尖周炎組。結論:Cyl可促進TNF-α、IL-1β及MMP-8的表達,以增強對根尖周組織的破壞,促進根尖周炎癥的擴展,盡管它并不是調控這三種因子表達的唯一因素。
　　第三部分:不同環(huán)境中糞腸球菌溶血素基因表達量的實時熒光定量PCR檢測
　　方法:(1)在有氧與厭氧環(huán)境下制備溶血型糞腸球菌(ATCC29212

9、)菌懸液,分別做cyl基因的實時熒光定量PCR檢測。(2)SD大鼠66只,在開髓后3周初次感染慢性根尖周炎模型建模成功時對實驗牙行根管預備、封藥消毒2周后去封,根管內注入ATCC29212菌懸液,封閉洞口形成溶血型糞腸球菌再感染。分別在再感染后6小時、12小時、24小時、48小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周及6周時間點隨機處死6只大鼠,截取上頜骨,將牙齒取下,浸泡于1mLTRNZOL液中1小時后除去硬組織并放置于-80℃冰箱

10、保存。取樣完畢后統(tǒng)一行cyl基因的實時熒光定量PCR檢測。結果:厭氧環(huán)境下糞腸球菌的cyl表達量較有氧環(huán)境下高。在糞腸球菌再感染6小時的根管環(huán)境中,cyl表達量開始明顯升高,24小時達高峰,之后48小時開始明顯下降,1周達最低,其后從2周至6周不斷升高。其中96小時到4周的五組時間點表達量均很低,甚至低于有氧組。但在5周和6周表達量迅速升高,6周又呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。結論:周圍環(huán)境氧濃度的降低可促進cyl表達;短期內周圍環(huán)境營養(yǎng)物質的驟然減