環(huán)境多重耐藥細(xì)菌中分子遺傳特征及耐藥傳播機(jī)制研究.pdf

1、目前，抗生素耐藥性問題已引起全球的廣泛關(guān)注。然而，抗生素耐藥細(xì)菌，尤其是環(huán)境中不同種屬的多重耐藥細(xì)菌中耐藥特征與耐藥傳播機(jī)制仍不清楚。因此，本研究以大量不同種屬的雞糞源多重耐藥細(xì)菌和不同環(huán)境源的多重耐藥大腸桿菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了其抗生素耐藥表型和分子遺傳特征。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴研究了33株不同種屬（13個(gè)屬21個(gè)種）的雞糞源多重耐藥細(xì)菌中耐藥遺傳特征。采用8類11種抗生素對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)粒和基因組DNA同時(shí)進(jìn)

2、行8類61種抗生素耐藥基因和18種可移動(dòng)元件的檢測(cè)，并對(duì)整合子和ISCR1所介導(dǎo)的耐藥基因盒進(jìn)行檢測(cè)，主要結(jié)果如下:第一，33株菌均為多重耐藥細(xì)菌，且93.94％的菌株具有5種以上的抗生素耐藥性。第二，33株菌中共檢測(cè)到8類47種耐藥基因，每一株菌內(nèi)檢出27～36種耐藥基因，且四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥基因檢出率最高，而鏈陽菌素類和萬古霉素類檢出率最低。第三，33株菌中共檢測(cè)到12種可移動(dòng)元件，且intI1、IS26、ISAba1、ISEc

3、p1和ISCR1的陽性檢出率均超過90％。對(duì)intI1、intI2和ISCR1的可變區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，共得到9種不同的基因盒(739～4754bp)。intI1介導(dǎo)的基因盒種類最多為豐富多樣，有7種:dfrA12+orfF+aadA2、aadB+cat+blaOXA-10+aadA1+dfrA1+aac4、aac(6')-Ⅱ+blaOxA-21+catB3+aadA1+ybxI、dfrV、accA4+cmlA1、dfrA16+aadA2+cm

4、lA1和aadA1;intI2和ISCR1均只攜帶一種基因盒，分別為:dfrA1+sat2+aadA1+ybeA和orf513+blaDHA-1+ampR。其中，dfrA12+orfF+aadA2的分布最為普遍(n=16)，在23個(gè)intI1介導(dǎo)的基因盒中占73.91％。第四，33株菌的耐藥基因型與耐藥表型高度一致，且大環(huán)內(nèi)酯類一致性最高(96.97％)。⑵研究了不同環(huán)境來源的多重耐藥大腸桿菌中耐藥遺傳特征。以畜禽糞便、城市污水處理廠剩

5、余污泥和醫(yī)院廢水中分離的共計(jì)55株多重耐藥大腸桿菌為研究對(duì)象，采用8類11種抗生素對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)其中35株菌的質(zhì)粒和基因組DNA進(jìn)行8類61種抗生素耐藥基因、18種可移動(dòng)元件及質(zhì)粒的檢測(cè)，并對(duì)整合子和ISCR1所介導(dǎo)的耐藥基因盒進(jìn)行檢測(cè)，主要結(jié)果如下:第一，55株多重耐藥大腸桿菌均具有10種以上抗生素耐藥性。第二，35株多重耐藥大腸桿菌中共檢測(cè)到8類35種抗生素耐藥基因，氨基糖苷類、磺胺類和喹諾酮類耐藥基因最為普遍，而大環(huán)內(nèi)酯類、

6、萬古霉素類和鏈陽菌素類耐藥基因最少，且不同環(huán)境源的多重耐藥大腸桿菌所攜帶的耐藥基因種類相對(duì)一致。第三，不同環(huán)境來源的多重耐藥大腸桿菌中所攜帶質(zhì)粒的多樣性存在明顯的差異。其中，醫(yī)院廢水源耐藥大腸桿菌中所含質(zhì)粒高度一致(90％)，而畜禽糞便和城市污水處理廠剩余污泥中相對(duì)多樣。第四，35株多重耐藥大腸桿菌共檢測(cè)到13種可移動(dòng)元件，且ISEcp1、IS26、ISAba1、ISCR1、TnpA/Tn21和intI1在三種不同的環(huán)境中檢出率均為10

7、0％。對(duì)intI1、intI2和ISCR1的可變區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，共得到11種不同的基因盒，其中，intI1中檢測(cè)到7種，intI2中僅檢測(cè)到同一種基因盒，ISCR1可變區(qū)檢測(cè)到3種基因盒。不同環(huán)境源的多重耐藥大腸桿菌中，intI1所攜帶耐藥基因盒的多樣性具有明顯的差異:醫(yī)院廢水源多重耐藥大腸桿菌中僅檢測(cè)到一種基因盒（dfrA17+aadA5），具有明顯的單一性和高度的一致性;糞源多重耐藥大腸桿菌中檢測(cè)到6種耐藥基因盒(dfrA17+aadA

8、5、aadA2、aadA22、aadA23、aac(6')-Ib+aadA22和dfrA12+orfF+aadA2）;而城市污水處理廠活性污泥中檢測(cè)到4種耐藥基因盒(dfrA17+aadA5、aadA22、dfrA12+orfF+ aadA2和aac(6')-Ib-like+cmlA1-like），且其中有2株菌同時(shí)攜帶兩種基因盒(aadA22/ dfrA17+aadA5和aadA22/dfr12+orfF+aadA2)。不同環(huán)境中耐藥

9、基因盒的多樣性差異，在一定程度上暗示了其所處環(huán)境的差異性和復(fù)雜程度。⑶對(duì)彭氏變形桿菌(Proteus penneri) ss4中的質(zhì)粒進(jìn)行分離測(cè)序和鑒定。第一，彭氏變形桿菌ss4中存在五條明顯的質(zhì)粒條帶，按照電泳遷移率由慢到快依次為pY1、pY2、pY3、pY4和pY5。第二，采用酶切克隆和高通量測(cè)序的方法，分別得到全長(zhǎng)為2373bp的質(zhì)粒pY5和3263bp的pY3。第三，序列分析表明，pY3和pY5均未攜帶任何耐藥基因，但pY3攜帶

10、三個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因，且pY3和pY5間有一段1369bp的序列高度相似(97.31％)，暗示了同一株菌內(nèi)質(zhì)粒間的相互關(guān)聯(lián)。第四，經(jīng)質(zhì)粒電泳圖譜、酶切圖譜和序列比對(duì)，證實(shí)pY4和pY5為同一質(zhì)粒的兩種形式，即pY5為超螺旋質(zhì)粒，而pY4為線型質(zhì)粒。菌株ss4的質(zhì)粒DNA中檢測(cè)到了28種耐藥基因，但質(zhì)粒pY3、pY4(或pY5)上均未攜帶任何耐藥基因，表明小質(zhì)粒不是該菌攜帶耐藥性的主要載體。該變形桿菌內(nèi)可能存在一些15kb以上的大質(zhì)粒，有待于進(jìn)