禽源大腸桿菌、奇異變形桿菌多重耐藥的分子特征及CTX-M基因傳播擴(kuò)散機(jī)制.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛使用，禽源腸桿菌科細(xì)菌對(duì)藥物的抗性快速傳播，尤其呈多重耐藥的細(xì)菌更為明顯。過(guò)去十幾年，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌已經(jīng)廣泛流行，并呈現(xiàn)多樣性，這很多程度上是由于CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因的出現(xiàn)。該型基因常常在人類、食品動(dòng)物、伴侶動(dòng)物、野生動(dòng)物和環(huán)境中發(fā)現(xiàn)。有多種原因使細(xì)菌能獲得多重耐藥，如接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)座、插入序列元件、編碼位點(diǎn)特異性整合的DNA移動(dòng)元件（整合子）。本試驗(yàn)的目的是研究禽源大腸桿菌、奇異變形桿菌多

2、重耐藥的分子特征及CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因傳播擴(kuò)散機(jī)制。
　　通過(guò)藥敏試驗(yàn)、ESBL和AmpC產(chǎn)酶確證、耐藥基因檢測(cè)、質(zhì)粒分析、接合試驗(yàn)、質(zhì)粒不相容性分群，研究禽源細(xì)菌的多重耐藥特性;通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分群和多位點(diǎn)序列分型研究禽源大腸桿菌的進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)PCR定位技術(shù)和分子克隆技術(shù)分析blaCTX-M的基因環(huán)境和rmtB基因的基因環(huán)境。
　　1.利用VITEK-32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)從不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的病死家禽中分離的64

3、株禽源分離菌進(jìn)行鑒定，獲得43株禽源大腸桿菌和21株奇異變形桿菌。ESBL和AmpC的確證試驗(yàn)結(jié)果表明:43株禽源大腸桿菌中有19株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)胺酰酶，1株產(chǎn)AmpC酶;分離的21株奇異變形桿菌中，有10株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)胺酰酶，6株產(chǎn)AmpC酶。藥物敏感性試驗(yàn)表明超廣譜β-內(nèi)胺酰酶的禽源大腸桿菌和奇異變形桿菌表現(xiàn)不同的耐藥特征。大部分菌株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、卡那霉素耐藥。此外，有4株大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物（卡那霉素、慶大

4、霉素、阿米卡星）呈現(xiàn)高水平耐藥。本試驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育分析表明:4株大腸桿菌屬于D群，其余屬于A群。多位點(diǎn)序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)結(jié)果表明:20株大腸桿菌屬于11種ST序列，表現(xiàn)了高的差異性。
　　2.本試驗(yàn)通過(guò)接合試驗(yàn)獲得了15株大腸桿菌的接合子。大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)表明:16株大腸桿菌產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶;19株產(chǎn)CTX型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，其中1株為CTX-M-3，5株為CTX-M

5、-14，2株為CTX-M-55，1株為CTX-M-24，1株為CTX-M-27，9株為CTX-M-65。5株產(chǎn)OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;1株產(chǎn)CMY-2型AmpC酶;奇異變形桿菌耐藥基因檢測(cè)表明:10株產(chǎn)TEM型β-內(nèi)酰胺酶;10株產(chǎn)CTX型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，占48％(10/21)，其中CTX-M-14型的6株，CTX-M-65型的4株;6株產(chǎn)CMY-2型AmpC酶，占29％(6/21);6株產(chǎn)OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，其

6、中的1株還同時(shí)產(chǎn)OXA-10超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;SHV型基因在兩種菌中均沒(méi)有檢測(cè)到。
　　3.blaCTX-M的基因環(huán)境因其亞型不同而有差異。blaCTX-M-3、blaCTX-M-55、blaCTX-M-14、blaCTX-M-24、blaCTX-M-27、blaCTX-M-65上游均存在ISEcp1，但某些情況被IS26截?cái)嗷虮籌S10插入。重要的是，研究首次確定了一種新的blaCTX-M基因環(huán)境的結(jié)構(gòu)ISEcp1△-IS12

7、94-△ISEcp1-blaCTX-M-55-ORF477，在此結(jié)構(gòu)中，ISEcp1被一個(gè)完整的IS1294截?cái)啵烟峤籒CBI獲得序列號(hào)JN977127。上游ISEcp1與blaCTX-M基因的間隔區(qū)也有差異，對(duì)blaCTX-M-55是45bp，也有48bp，對(duì)CTX-M-9族基因均為42bp。對(duì)于下游，核酸序列分析表明，CTX-M-I族的blaCTX-M-3和blaCTX-M-55是orf477，對(duì)CTX-M-9族是IS903，但有

8、的被截?cái)?。結(jié)果也同時(shí)表明blaCTX-M基因多位于IncI1和IncF可接合性質(zhì)粒上，blacmy-2基因位于IncA/C可接合性質(zhì)粒上。
　　4.4株大腸桿菌中檢測(cè)到rmtB基因(9％，4/43)，占產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因的大腸桿菌20％(4/20)。值得注意的是，含有這種基因的大腸桿菌還同時(shí)產(chǎn)CTX-M型ESBL和CMY-2型AmpC。這對(duì)臨床使用β-內(nèi)酰胺類抗生素和氨基糖苷類抗生素構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在1株大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)blaCT

9、X-M-55和rmtB基因分別位于不同的質(zhì)粒上IncI1和IncN，這種抗性質(zhì)?？梢詥为?dú)也可以一起通過(guò)接合而傳遞，結(jié)果也同時(shí)顯示rmtB基因被Tn3轉(zhuǎn)座子攜帶。
　　綜上，產(chǎn)ESBL的大腸桿菌在禽類中廣泛流行，CTX-M也呈多樣性流行。blaCTX-M的基因環(huán)境因亞型不同而有差異。核酸序列表明，blaCTX-M基因的上游存在ISEcp1元件;blaCTX-M基因的下游在CTX-M-1組是orf477，在CTX-M-9族是IS903