雞奇異變形桿菌致病性相關(guān)毒素檢測及PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞奇異變形桿菌病是近年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性熱性細菌性傳染病。本病的特征是呼吸困難、咳嗽、體溫升高、腹瀉?；疾〖仪葜饕憩F(xiàn)為菌血癥、敗血癥，一側(cè)性或兩側(cè)性癱瘓或水樣腹瀉。各種日齡的雞群都可感染本病，但以7周齡以下的雛雞最易感。種雞感染本病后可通過種蛋傳給后代，從而造成雛雞的大批死亡。此病十分容易造成爆發(fā)性流行疾病，因此對養(yǎng)殖業(yè)是一種潛在的威脅。奇異變形桿菌的致病機理與其本身所含的一些毒力因子密切相關(guān)，據(jù)推測這些毒力因子可能在雞奇異變形桿

2、菌的病理發(fā)生和免疫方面產(chǎn)生重要的作用?；谏鲜瞿康谋狙芯窟x取了奇異變形桿菌內(nèi)毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素和氣管細胞毒素進行研究，初步了解奇異變形桿菌的致病機理，為研究雞奇異變形桿菌的保護性抗原提供重要依據(jù)。目前，有關(guān)奇異變形桿菌的檢測通常采用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)、生化試驗和血清學試驗等多個步驟，其檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低，不適應奇異變形桿菌的快速檢測。近年來發(fā)展起來的分子生物學方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足。因此本研究建立了奇異變形桿菌的PC

3、R和多重PCR檢測方法，為該抗原的快速檢測提供技術(shù)依據(jù)，以做到更好的控制該病的發(fā)生與蔓延。本研究主要包括三部分：
　　 ⑴雞奇異變形桿菌相關(guān)毒素的檢測及其致病性研究。本試驗精提了奇異變形桿菌內(nèi)毒素和粗提了熱穩(wěn)定腸毒素，通過動物試驗研究其致病性。同時建立起雞胚氣管環(huán)模型，驗證氣管細胞毒素的存在及其對氣管纖毛上皮的致病作用。結(jié)果表明：奇異變形桿菌內(nèi)毒素可使動物呈急性敗血癥病變。分離的8株奇異變形桿菌有1株為ST陽性，注射ST后的乳鼠

4、運動遲緩、食欲不振，剖檢可見腸水腫,腸腔積液等。奇異變形桿菌P5、P8株分別作10-8.5、10-8.3倍稀釋，可使SPF雞胚氣管環(huán)接種0.1mL后50％出現(xiàn)氣管環(huán)纖毛脫落，氣管環(huán)粘膜出現(xiàn)凹陷、空洞，初步驗證了氣管細胞毒素的存在及奇異變形桿菌對氣管纖毛的損傷機理。
　　 ⑴奇異變形桿菌分離株的23S rRNA序列分析。本試驗通過PCR反應擴增7株雞奇異變形桿菌和1株兔奇異變形桿菌的23S rRNA基因片段（1045bp），經(jīng)克隆

5、測序，與GenBank中收錄的奇異變形桿菌、普通變形桿菌以及其它相近屬的23S rRNA基因序列進行同源性比較，并由此構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)生樹。本實驗室保存的7株雞奇異變形桿菌核苷酸序列與GenBank中收錄的奇異變形桿菌核苷酸序列同源性為99.4％～99.8％，與兔奇異變形桿菌核苷酸序列同源性為98.8％～99.3％，與普通變形桿菌的核苷酸序列同源性為95.4％～96.2％，而與其它相近屬同源性只有92.9％～93.4％。結(jié)果顯示,23S

6、rRNA基因序列分析可以作為鑒定奇異變形桿菌的一種快速、簡便、準確的方法。
　　 ⑶多重PCR檢測三種重要食源性致病菌方法的建立及應用。本試驗根據(jù)奇異變形桿菌尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因（ureR）、沙門氏菌侵襲性抗原保守基因（invA）和單核細胞增生性李氏桿菌編碼溶血素O(LLO)的 hlyA基因分別設計了三對特異性引物，對單基因PCR和單管多重PCR擴增的特異性、敏感性分析以及建立引物濃度、Tm值、模板量的L16(43)正

7、交試驗，優(yōu)化單管多重PCR擴增條件，建立了快速檢測奇異變形桿菌、沙門氏菌和單核細胞增生性李氏桿菌的穩(wěn)定的單管多重PCR方法。結(jié)果顯示，三種目的菌在105cfu/ml均可同時擴增出較清晰條帶(奇異變形桿菌和單核細胞增生性李氏桿菌在104cfu/ml濃度下仍然可見到條帶)，比單基因PCR低一個稀釋度，并且人工模擬試驗和市售食品試驗檢測結(jié)果穩(wěn)定。表明該多重PCR檢測方法操作簡單、快速、特異性強和靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)對奇異變形桿菌、沙門氏菌和單核