槐花多糖對(duì)雞奇異變形桿菌OmpA基因工程亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效果.pdf

1、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，P.mirabilis)是一種急性條件致病菌，廣泛分布于自然界中，各種日齡的雞群均易感染奇異變形桿菌，該菌主要引起雞肢腿癱瘓、腹瀉、腦軟化、敗血癥等癥狀。本病既可水平傳播，又能垂直傳播，很容易引起爆發(fā)性流行疾病。近些年奇異變形桿菌在雞群中的感染率逐漸升高，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的負(fù)面影響。目前無(wú)有效的疫苗預(yù)防，研發(fā)新型疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。OmpA是大多數(shù)革蘭陰性菌外膜蛋白的主要成分，Kom等人

2、證明奇異變形桿菌OmpA能夠刺激小鼠B淋巴細(xì)胞大量增殖，具有良好的免疫原性。而巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、重組蛋白分泌表達(dá)以及對(duì)外源蛋白翻譯后修飾等特點(diǎn)。此外，酵母表達(dá)的蛋白無(wú)內(nèi)毒素。因此，本研究對(duì)奇異變形桿菌OmpA進(jìn)行巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)，利用表達(dá)產(chǎn)物與槐花多糖佐劑構(gòu)建成基因工程重組亞單位疫苗。本研究的目的是探索槐花多糖對(duì)雞奇異變形桿菌OmpA基因工程亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效果

3、。
　　1.奇異變形桿菌OmpA畢赤酵母表達(dá)
　　根據(jù)GenBank中發(fā)表的雞奇異變形桿菌OmpA基因序列(參考序列號(hào)為NC_010554.1)設(shè)計(jì)特異性引物，以奇異變形桿菌Q1株為模板PCR擴(kuò)增OmpA基因，大小為1107bp，構(gòu)建pMD18T-OmpA克隆載體進(jìn)行測(cè)序。重組質(zhì)粒pMD18T-OmpA經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后回收OmpA基因，連接到pPIC9質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9-OmpA，經(jīng)SacⅠ線性化后Li

4、cl轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，RDB平板篩選陽(yáng)性子轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定目的基因成功整合到畢赤酵母基因組中。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)1.0％甲醇誘導(dǎo)96 h后OmpA濃度達(dá)到0.8μg/mL，SDS-PAGE顯示重組蛋白大小約為52 kDa。Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)重組蛋白能與兔多抗原核表達(dá)的OmpA血清發(fā)生反應(yīng)。表明雞奇異變形桿菌OmpA成功表達(dá)。
　　2.槐花多糖對(duì)雞奇異變形桿菌重組亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效果
　　為研究

5、槐花多糖佐劑對(duì)奇異變形桿菌OmpA基因工程亞單位疫苗免疫反應(yīng)的影響，將提取的槐花多糖與酵母表達(dá)的OmpA等體積配比制成重組亞單位疫苗。將360只1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為6組，分別注射3個(gè)不同多糖劑量(100mg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL)的OmpA疫苗，弗氏佐劑-OmpA，純化OmpA以及生理鹽水。分別檢測(cè)外周血抗體效價(jià)、外周血清IL-2濃度、外周血T淋巴細(xì)胞增殖率、外周血CD4+、CD8+細(xì)胞百分比以及疫苗免疫保護(hù)