泰山松花粉多糖對畢赤酵母表達的禽波氏桿菌OmpA的免疫增強效果研究.pdf

1、禽波氏桿菌病是由禽波氏桿菌（Bordetella avium，B. avium）引起的一種家禽上呼吸道性傳染性疾病，既可水平傳播，也可垂直傳播，主要導致死胚率升高，孵化率降低和雛雞的急性死亡。患病雞生長遲緩、飼料報酬低，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。有研究表明，本菌還是人體的一種機會致病菌。目前，由于藥物殘留的影響以及禽波氏桿菌耐藥性的形成，通過抗生素治療本病的難度越來越大。關于禽波氏桿菌病的預防，國外僅對火雞波氏桿菌病疫苗開展了研究。

2、目前用于預防火雞波氏桿菌病的疫苗包括溫度敏感變異株活菌苗和全細胞菌素，但這兩種疫苗只能適當降低病變的嚴重程度以及延緩臨床癥狀的出現(xiàn)，并不能從根本上防止本病的傳播。因此急需開辟新的途徑，研發(fā)新型疫苗。佐劑可以激活機體的先天免疫系統(tǒng)進而增強機體對特異性抗原的適應性免疫，從而使機體產(chǎn)生高效持久的免疫反應，因此，疫苗佐劑在免疫過程中是不可或缺的。本實驗室前期的研究表明，泰山松花粉多糖（Taishan Pinus massoniana polle

3、n polysaccharide，TPPPS）作為滅活疫苗和亞單位疫苗佐劑具有良好的免疫增強效果，但其對真核表達的外膜蛋白A（outer membrane protein A，ompA）的免疫效果研究未見報道。因此，本研究以畢赤酵母表達系統(tǒng)為基礎，分泌表達重組的禽波氏桿菌ompA，采用TPPPS為疫苗佐劑，并評估其對重組禽波氏桿菌ompA亞單位疫苗的免疫增強效果。
　　根據(jù)GenBank中禽波氏桿菌ompA基因序列設計一對引物，以

4、實驗室分離得到的禽波氏桿菌DNA為模板，PCR擴增目的基因。將PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，經(jīng)測序驗證正確后，重組克隆載體進行EcoR I和Not I雙酶切，膠回收產(chǎn)物連接到相同酶切的表達載體 pPIC9上，重組表達載體線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 GS115感受態(tài)細胞中，RDB板篩選禽波氏桿菌ompA畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定并進行基因測序。同時，轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPIC9并篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子作為陰性對照。
　　采用甲醇

5、誘導法誘導禽波氏桿菌ompA畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子分泌表達ompA，同時對空質(zhì)粒畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進行誘導表達，作為陰性對照。于誘導后24、48、72、96 h分別離心收集上清，通過SDS-PAGE和Western blot分析進行檢測。經(jīng)鑒定，在SDS-PAGE凝膠中有一條大小為21 kDa的條帶，其分子量大小與目的蛋白分子量大小相一致，而陰性對照中并沒有該蛋白條帶。鎳柱純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析只檢測到一條大小為21 kDa蛋白條帶。

6、Western blot分析中也出現(xiàn)大小為21kDa的特異性條帶，與SDS-PAGE檢測結果相一致。
　　動物試驗中，將180只SPF雞隨機分為6組，3日齡首免，分別頸部皮下接種0.2mL20、40、60mg/mL TPPPS佐劑ompA亞單位疫苗，不完全弗氏佐劑ompA亞單位疫苗，單純的ompA亞單位疫苗和PBS，于首免后7和14d分別進行加強免疫。首免后3、7、14、21、28、35、42、49 d，每組隨機取3只雞采血，并檢

7、測其血清抗體效價，血清白細胞介素-4（IL-4）濃度，外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞百分含量，T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。三免后1周，每組（除對照組）隨機取20只雞進行動物保護試驗，連續(xù)7d觀察記錄臨床癥狀和存活率。結果表明，單純的ompA亞單位疫苗能有效誘導機體產(chǎn)生抗-ompA抗體，分泌IL-4，提高CD4+T淋巴細胞百分含量和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，并能提供71.67％的保護率。此外，TPPPS佐劑疫苗能顯著提高機體免疫反應水平，且60mg/m