松花粉防治腎臟衰老的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 21世紀(jì)世界人口老齡化問題越來越嚴(yán)重，人類面臨著老齡人口增多的問題，如何養(yǎng)老及延緩衰老等問題嚴(yán)峻地擺在我們面前。隨著衰老的發(fā)生，人體的各個器官相繼發(fā)生形態(tài)和功能的退變：細(xì)胞數(shù)減少，臟器萎縮、變性，組織彈性減低等等，從而導(dǎo)致多種生理功能逐漸減退，引發(fā)一系列的老年性疾病。其中腎臟的衰老和老年腎臟疾病越來越受到人們的重視。
　　 伴隨人口老齡化，慢性腎臟病在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)流行趨勢，并且醫(yī)療花費(fèi)巨大。腎臟是人體

2、的重要器官，也是容易衰老的器官，腎臟對維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著重要作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體的衰老開始于腎，腎為先天之本、生命之根。人體的生長壯老已皆由腎氣決定，腎元盛則壽延，腎元衰則壽夭。因此如能延緩腎臟衰老，則有可能延緩人體的衰老進(jìn)程。腎臟衰老過程中，臨床表現(xiàn)以腎功能減退最為突出，表現(xiàn)為腎小球濾過率和腎小管的重吸收功能均減退，腎臟的儲備能力下降；衰老腎臟光鏡下觀察具有腎小球硬化、腎小管萎縮或消失、腎血管硬化、結(jié)締組織增生等變化。
　

3、　 影響衰老的因素有很多，各種社會因素、經(jīng)濟(jì)、疾病、營養(yǎng)、遺傳、生活習(xí)慣、環(huán)境及精神狀態(tài)等都起著一定的作用，是很多因素共同作用的結(jié)果，但目前還沒有一種理論能解釋所有的衰老現(xiàn)象。20世紀(jì)后期，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究深入，衰老機(jī)理的研究目前已從整體水平、器官水平、細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平，生物學(xué)家們提出了各種學(xué)說從不同的角度闡述衰老的機(jī)理，如自由基學(xué)說、衰老的端區(qū)學(xué)說、線粒體DNA突變學(xué)說、微量元素學(xué)說、交聯(lián)學(xué)說、生物膜損傷學(xué)說、

4、遺傳程序?qū)W說、染色體突變學(xué)說等等。其中最具有影響力的學(xué)說就是自由基學(xué)說和線粒體DNA(mtDNA)突變學(xué)說。自由基學(xué)說主要認(rèn)為增齡的退行性變化是由自由基的副作用所引起的。自由基性質(zhì)活潑，極不穩(wěn)定，容易與其它物質(zhì)反應(yīng)生成新的自由基，因而往往都有連鎖反應(yīng)。低濃度適量的自由基為人體生命活動所必需，它可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，刺激白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞殺滅細(xì)菌，消除炎癥，分解毒物。但自由基含有未配對電子，具有高度反應(yīng)活性，過量的自由基可引發(fā)鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)、引

5、起不飽和脂肪酸氧化成超氧化物，形成脂褐素引起機(jī)體損傷。氧自由基過多還會破壞細(xì)胞膜及其他重要成份，使蛋白質(zhì)和酶變性，當(dāng)自由基引起的損傷積累戰(zhàn)勝了機(jī)體的修復(fù)能力，導(dǎo)致細(xì)胞分化狀態(tài)的改變、甚至喪失，從而導(dǎo)致和加速機(jī)體衰老。線粒體DNA突變學(xué)說提出，線粒體具有三羧酸循環(huán)、電子傳遞和氧化磷酸化的作用，線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應(yīng)為有機(jī)體生成約90％的能量(ATP)，因而被稱為細(xì)胞的氧化中心和“動力工廠”。線粒體是哺乳動物細(xì)胞除細(xì)胞核之外唯一含

6、有DNA的細(xì)胞器，并擁有自己的遺傳密碼和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。線粒體DNA呈雙鏈環(huán)狀，人類mtDNA長16569 bp，含37個基因，均為線粒體氧化磷酸化正常功能所必需。mtDNA本身缺乏組蛋白保護(hù)及相應(yīng)的修復(fù)系統(tǒng)，易受氧自由基攻擊而誘發(fā)突變，由于mtDNA中各基因排列緊密利用率高，因而mtDNA任何部位的突變都會累及到基因中的一個重要功能區(qū)域，最終導(dǎo)致氧化磷酸化功能受損導(dǎo)致能量產(chǎn)出缺陷、衰老和細(xì)胞死亡。
　　 衰老理論的創(chuàng)新為抗衰老

7、藥物的篩選和藥效研究提供了有力的依據(jù)。對養(yǎng)生延壽的探索，我國已有3000多年的歷史，對各種具有強(qiáng)身健體和補(bǔ)益作用的藥物的研究資料十分豐富。多年的醫(yī)藥學(xué)科研實踐證明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和中醫(yī)中藥結(jié)合，在延緩衰老藥物的開發(fā)上具有特定優(yōu)勢。
　　 松花粉(pine pollen)藥名松黃，是一種營養(yǎng)價值高，藥理作用廣的中藥保健品，含有松樹植株所具有的一切營養(yǎng)成分和生命活性物質(zhì)，總量達(dá)到200余種。其成分穩(wěn)定、易被機(jī)體吸收利用，藥理實驗證明，

8、松花粉中含有大量抗氧化物質(zhì)，如維生素E、胡蘿卜素及微量元素硒，可以抑制體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有延緩衰老的作用。
　　 目的：
　　 觀察松花粉對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠腎臟的保護(hù)作用，并根據(jù)衰老的自由基學(xué)說、mtDNA突變學(xué)說兩方面探討其延緩腎臟衰老作用的機(jī)理，從而進(jìn)一步拓展松花粉的臨床使用范圍，并為開發(fā)研制出抗衰老新藥奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 所有小鼠在相同條件下，自由飲水，攝食，保持

9、自然光照，無不良因素影響，飼養(yǎng)一周適應(yīng)實驗室環(huán)境后開始進(jìn)行實驗。將30只清潔級、健康雄性昆明小白鼠隨機(jī)分為3組：青年對照組、衰老模型組、松花粉治療組，每組10只。本實驗的動物模型為亞急性衰老小鼠模型，所采用的造模方法為：D-半乳糖亞急性衰老模型建立法。實驗開始后，衰老模型組、松花粉治療組小鼠采用每天5％D-半乳糖溶液100 mg/kg頸背部皮下注射，復(fù)制亞急性衰老小鼠模型，青年對照組小鼠給予相應(yīng)的生理鹽水。松花粉治療組小鼠在造模的同時每

10、天給予750mg/kg體重的松花粉灌胃，青年對照組與衰老模型組小鼠則以等體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)50d后，采取血清、腎臟組織。觀察各組的腎臟解剖形態(tài)學(xué)、組織形態(tài)學(xué)改變；檢測各組的血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、腎臟組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及其丙二醛(MDA)的含量，并提取各組小鼠腎臟組織中的mtDNA，檢測其mtDNA的相對含量；并采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測各組小鼠腎臟組織mtDNA的片段缺失情況。
　　

11、結(jié)果
　　 1、與青年對照組相比，衰老模型組小鼠體重增長緩慢、腎臟系數(shù)降低(P<0.05)；與衰老模型組相比，松花粉治療組小鼠體重增長顯著加快、腎臟系數(shù)提高(P<0.05)； 2、青年對照組小鼠單位視野內(nèi)腎小球數(shù)量較多，呈圓形或橢圓形，外周規(guī)整，腎小囊的囊腔正常，腎小管的管腔規(guī)整；衰老模型組小鼠腎小球分布稀疏，不規(guī)整，腎小球球體相應(yīng)縮小，腎小囊的囊腔明顯擴(kuò)大，基底膜增厚，腎小管的管腔擴(kuò)大，細(xì)胞核深染、固縮，系膜增生明顯;松花粉治

12、療組腎小球數(shù)量與衰老組相比明顯增多，腎小球萎縮、系膜增生等均較衰老模型組明顯減少，腎小囊囊腔有所減小，基底膜增厚不明顯；3、衰老模型組與青年對照組比較，Scr和BUN水平顯著提高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，BUN和Scr水平顯著下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；4、衰老模型組與青年對照組比較，腎組織SOD活性顯著降低，其MDA含量顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，腎

13、組織SOD活性顯著升高，其MDA含量顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；5、衰老模型組與青年對照組比較，腎臟mtDNA相對含量顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；松花粉治療組與衰老模型組比較，腎臟mtDNA相對含量顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；6、衰老模型組及松花粉治療組小鼠腎臟mtDNA中存在明顯的缺失片段，而在青年對照組小鼠腎臟mtDNA中未檢測到相同片段的缺失，松花粉治療組與衰老模型組比較，小鼠腎臟mtDNA的缺

14、失率顯著降低(t=11.781，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、松花粉能促進(jìn)衰老小鼠體重的增加，改善其腎臟解剖形態(tài)學(xué)的衰老改變。
　　 2、松花粉能夠改善衰老小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)衰老改變。
　　 3、松花粉能夠改善衰老小鼠的腎功能。
　　 4、松花粉可減輕衰老腎臟的氧化損傷，其可能是松花粉延緩腎臟的衰老的機(jī)制之一。
　　 5、松花粉能夠保護(hù)衰老腎臟的mtDNA、可以抑制衰老腎臟mt