重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、[目的]： 建立重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，具體包括： （1）霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （2）O1群和0139群霍亂弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （3）霍亂毒素基因（ctx）TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （4）副溶血弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （5）耐熱直接溶血素基因（tdh）和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素基因（trh）

2、 雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （6）創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （7）霍亂毒素基因和耐熱直接溶血素基因雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法 （8）嗜水氣單胞菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。 [方法]： 對(duì)“目的”中涉及的前7個(gè)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，本研究采取如下實(shí)驗(yàn)方案： （1）查閱文獻(xiàn)確定待檢測(cè)的目的基因，通過序列比對(duì)確定待檢基因的保守序列，然后借助引物探

3、針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer7.0設(shè)計(jì)單重和（或）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR引物和探針。 （2）引物擴(kuò)增待測(cè)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與T載體連接制備擴(kuò)增產(chǎn)物克隆子，挑選陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)。用EasyDilution將上述質(zhì)粒依次稀釋成1.0×1010拷貝/μl—1.0×100拷貝/μl。 （3）分別在100—1000 nmol/L10個(gè)濃度梯度和100—500 nmol/L5個(gè)濃度梯度內(nèi)，借助方差

4、分析優(yōu)化引物和探針的濃度。 （4）單重實(shí)時(shí)PCR靈敏度和特異度的評(píng)價(jià)。 （5）以1.0×108拷貝/μl—1.0×100拷貝/μl9個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒為模板，每個(gè)濃度梯度做8個(gè)平行樣，在伯樂公司的CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，確定單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)下限以及擴(kuò)增效率。 （6）將優(yōu)化了的單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系組合成雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系，并對(duì)雙重實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)下限進(jìn)行評(píng)價(jià)。 對(duì)嗜

5、水氣單胞菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)下限的評(píng)價(jià)包括菌液的檢測(cè)下限和DNA的檢測(cè)下限。將一系列稀釋度的嗜水氣單胞菌菌液人工污染健康人的糞便，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法從未經(jīng)增菌處理的糞便中以及增菌3小時(shí)、8小時(shí)和16小時(shí)的糞便中檢測(cè)出嗜水氣單胞菌的能力。 [結(jié)果]： 建立了重要致病性弧菌的TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。具體結(jié)果為： （1）霍亂弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein W，ompW

6、）和擬態(tài)弧菌的溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin，vmh）作為霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中，霍亂弧菌引物和探針的濃度分別為100 nmol/L和200 nmol/L；擬態(tài)弧菌引物和探針的濃度分別為100 nmol/L和100 nmol/L。該反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)兩種質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限均為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率分別為

7、：100.9%和99.7%。 （2）O1和O139的O抗原合成基因rfb基因作為O1群和O139群霍亂弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中，O1的引物和探針的濃度均為200 nmol/L； O139的引物和探針的濃度均為200 nmol/L。該反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)兩種質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限均為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率分別為：101.4%和99.9%。

8、（3）優(yōu)化的霍亂毒素基因?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)體系中，ctx引物和探針的濃度均為200 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)ctx質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率為99.8%。 （4）副溶血弧菌的toxR基因被選作副溶血弧菌的特異性基因。優(yōu)化的toxR引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L；反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。該反應(yīng)體系對(duì)toxR質(zhì)粒模板的

9、檢測(cè)下限為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率為100.1%。 （5）優(yōu)化的tdh和trh雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，tdh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L； trh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。該反應(yīng)體系對(duì)兩種質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限均為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率分別為：97.3%和100.1%。 （6）創(chuàng)傷弧菌的溶血素基因（Vibrio v

10、ulnificus hemolysin，vvh）和溶藻弧菌的膠原酶基因（Vibrio alginolyticus collagenase，col）被選作為創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中，創(chuàng)傷弧菌引物和探針的濃度均為200 nmol/L；溶藻弧菌引物和探針的濃度均為200 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)兩種質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限均為1.0×102拷貝/μl

11、，擴(kuò)增效率分別為：100.5%和101.5%。 （7）優(yōu)化的tdh和ct雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，ct引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L； tdh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)兩種質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限均為1.0×102拷貝/μl，擴(kuò)增效率分別為：94%和97.7%。 （8）嗜水氣單胞菌的主要粘

12、附素基因（Aeromonas hydrophila major adhesion gene，aha）被選為嗜水氣單胞菌的特異性基因。優(yōu)化的引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。該反應(yīng)體系對(duì)純培養(yǎng)物DNA的檢測(cè)下限為1 pg/μl，對(duì)菌液的檢測(cè)下限為80 CFU/ml。對(duì)未經(jīng)增菌的人工污染糞便標(biāo)本的檢測(cè)下限為8×103 CFU/ml，增菌3小時(shí)對(duì)檢測(cè)下限沒有影響，增菌8小時(shí)

13、和16小時(shí)后，檢測(cè)下限能達(dá)到8 CFU/ml。 [結(jié)論]： 本研究建立了基于TaqMan探針的重要致病性弧菌的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明它們具有令人滿意的靈敏度和特異度。檢測(cè)下限能達(dá)到1.0×102拷貝/μl，高于普通PCR10—1000倍。并且雙重實(shí)時(shí)PCR能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)兩種菌或者兩個(gè)致病基因，大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和對(duì)試劑的消耗。因此，上述檢測(cè)方法可用于重要致病性弧菌的快速檢測(cè)及篩查，尤其是當(dāng)樣本量很