液相芯片技術(shù)和LAMP技術(shù)檢測(cè)致病性弧菌的研究.pdf

1、弧菌（Vibrio）廣泛分布在海洋、江河和湖泊的水體中，從兩極的極冷環(huán)境到赤道的熱帶環(huán)境的水域中都有分布，隨著人們生活水平的提高，對(duì)海產(chǎn)品的需求量越來越大，弧菌已然成為了威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖和人們的身體健康的重要病原菌，但是弧菌的種類繁多，使在檢測(cè)和防治方面受到了巨大的挑戰(zhàn)，所以建立弧菌的多重檢測(cè)和基層檢測(cè)是非常必要的。副溶血弧菌是弧菌中威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原弧菌，每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，副溶血弧菌有兩條染色體，每條染色體上各有一個(gè)不同的外

2、膜蛋白o(hù)mpA的編碼基因，分別為VP0764和VPA1186兩段基因，取這兩段基因分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，F(xiàn)/R引物上分別具有BamH和Sacl酶切位點(diǎn)，用BL21載體進(jìn)行蛋白表達(dá)，純化鑒定之后用來制備多抗，然后進(jìn)行免疫磁珠的制備進(jìn)行菌體捕捉。以副溶血弧菌的毒力因子基因(vptdh)和特異性基因(vptox)、霍亂弧菌的腸毒素基(vcctx)和外膜蛋白基因(vcomp)和溶血素基因(vchly)、擬態(tài)弧菌的溶血素基因(vmha)和特異性基因(

3、vmtox)、創(chuàng)傷弧菌的溶血素基因(vvha)和創(chuàng)傷弧菌多重毒素基因(vvrtx)、溶藻弧菌的膠原蛋白酶基因(vacol)為目的基因設(shè)計(jì)引物和特異性微球探針，進(jìn)行液相芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究。設(shè)計(jì)的引物與五種弧菌以及大腸桿菌、沙門氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物與特異性探針雜交讀數(shù)，證明得到液相芯片技術(shù)具有很好的特異性;特異性探針與不同菌濃度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，證明得到其具有很高的靈敏度;十種特異性探針分別與單一PCR產(chǎn)物和混合PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，證

4、實(shí)液相芯片技術(shù)多重檢測(cè)的可操作性。搜索創(chuàng)傷弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A，HA)和多重毒素(repeats in toxin，RTX)毒力基因的并設(shè)計(jì)兩種基因的內(nèi)、外引物，進(jìn)行LAMP檢測(cè)目的基因和人工模擬樣品，通過肉眼觀察白色沉淀，初步判斷檢測(cè)結(jié)果，再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。LAMP檢測(cè)兩種目的基因靈敏度達(dá)到10CFU/ml，人工模擬樣品檢測(cè)的靈敏度分別為1×102CFU/g(VV-RTX)和1×10