鴨源大腸桿菌tetM基因的檢測及其傳播擴(kuò)散機(jī)制.pdf

1、四環(huán)素類藥物由于其價(jià)格的低廉，抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上被廣泛應(yīng)用。近年來，由于該類藥物在臨床上不合理使用、濫用，導(dǎo)致對該類藥物耐藥的菌株不斷增多，嚴(yán)重限制了四環(huán)素類藥物的使用。已知的細(xì)菌對四環(huán)素類耐藥機(jī)制共有四類:外排泵機(jī)制，核糖體保護(hù)機(jī)制，滅活酶機(jī)制以及靶位修飾機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯亢颂求w保護(hù)機(jī)制的代表性基因tetM在鴨源大腸桿菌中的基因環(huán)境，了解其傳播擴(kuò)散機(jī)制，為弄清tetM基因的表達(dá)以及臨床上尋找新的藥物靶標(biāo)提供重要的理論依

2、據(jù)。
　　1.受試菌為經(jīng)過VITEK32全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀并且經(jīng)過分離純化的21株鴨源大腸桿菌。用微量肉湯倍比稀釋法測定細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)，測定21株菌對鹽酸四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素、頭孢噻肟、恩諾沙星、硫酸阿米卡星、氟苯尼考、利福平等8中藥物的敏感率和耐藥率。結(jié)果顯示:21株鴨源大腸桿菌對其中六種抗菌藥物的的耐藥率都≥60％，對四環(huán)素類藥物中的土霉素和四環(huán)素耐藥率最高均達(dá)到了100％，對多西環(huán)素的耐藥率相對較低為75％，

3、對阿米卡星較為敏感耐藥的菌株僅有1株，耐藥率為4.76％，對頭孢噻肟，思諾沙星，氟苯尼考的耐藥率分別為28.5％，60.4％，81％，利福平達(dá)到100％，部分鴨源大腸桿菌呈現(xiàn)多重耐藥性。設(shè)計(jì)合成引物對這21株菌中含有tetM基因的情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:21株菌種攜帶tetM的陽性菌株數(shù)量為7株，檢測率為33.3％。
　　2.采用ERIC-PCR、多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing, MLST）和

4、系統(tǒng)發(fā)育分型等三種方法對7株鴨源大腸桿菌進(jìn)行發(fā)育分型。結(jié)果表明:7株代表菌株分屬于5個(gè)ERIC基因型，屬于5個(gè)不同的克降來源。其中W4和Y8具有高度的同源性都屬于A型，可認(rèn)為是同一克隆株，其次CY14和LF6也具有同源性屬于B型，5Y，E5，Y4分別屬于C，D，E型。MLST分類結(jié)果表明7株鴨源大腸桿菌代表菌株共有6個(gè)ST型，其中ST162，ST163親緣性較近，CY14和LF6屬于同一ST型。本研究還發(fā)現(xiàn)有1個(gè)新的ST序列(ST383

5、9)。實(shí)驗(yàn)顯示MLST分型與ERIC-PCR分型結(jié)果比較一致。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分型法對7株大腸桿菌的檢測結(jié)果表明，表明7株大腸桿菌中有4株屬于B1群，2株屬于A群，B1，A群是沒有致病性的。僅有一株菌屬于D群，具有毒力作用，可能是一種具有致病作用的大腸桿菌。
　　3通過濾膜接合試驗(yàn)觀察tetM基因質(zhì)粒的傳遞，通過Southern blot，進(jìn)行tetM基因的質(zhì)粒定位，質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)和southern blot結(jié)果共同顯示tetM基因位于

6、一個(gè)大小為50kb左右可接合的質(zhì)粒上;分別采用交叉定位PCR(PCR Mapping)和基因克隆方法研究tetM的基因環(huán)境:試驗(yàn)菌株為兩株含tetM基因的鴨源大腸桿菌，用pBluescript(Ⅱ) SK(+)作為載體質(zhì)粒，將供體菌質(zhì)粒和載體質(zhì)粒分別用EcoRⅠ進(jìn)行酶切。然后用T4連接酶將二者酶切產(chǎn)物進(jìn)行體外連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5a進(jìn)行表達(dá)，用LB/AMP/DOX/X-gal/IPTG平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落即為陽性重組質(zhì)