鴨源沙門氏菌與鴨源大腸桿菌融合菌株的構(gòu)建及鑒定分析.pdf

1、鴨沙門氏菌?。ㄓ置喐眰┖网喆竽c桿菌病是鴨場(chǎng)普遍存在的兩種細(xì)菌病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)中往往通過(guò)分別注射兩種細(xì)菌疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，費(fèi)時(shí)，成本也高，因而構(gòu)建鴨源沙門氏菌與鴨源大腸桿菌融合菌株可為預(yù)防鴨沙門氏菌病、鴨大腸桿菌病提供制備二聯(lián)疫苗所需的優(yōu)良菌株，對(duì)預(yù)防這兩種細(xì)菌病具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的、分離自四川、重慶地區(qū)不同鴨場(chǎng)的15株鴨源沙門氏菌和10株鴨源大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定及17種抗生素藥

2、敏試驗(yàn);篩選出一株血清型為6，7∶1，v:e，n，x，并對(duì)慶大霉素(Gentamicin，Gen)耐藥、四環(huán)素(Tetracycline，Tcy)敏感的鴨源沙門氏菌S7(6，7∶1，v∶e，n，x，GenR，TcyS)，以及一株血清型為O78，并對(duì)慶大霉素敏感、四環(huán)素耐藥的鴨源大腸桿菌D2(O78，GenS，TcyR)作為親本菌株;通過(guò)繪制S7、D2兩親本菌株生長(zhǎng)曲線，確定S7、D2原生質(zhì)體制備的最佳時(shí)間分別為14～16 h、10～12

3、 h;同時(shí)通過(guò)對(duì)S7、D2兩親本菌株的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定，確定高滲再生選擇性培養(yǎng)基中應(yīng)加入的慶大霉素濃度為16 ug/mL，四環(huán)素濃度為32ug/mL。抗生素濃度應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明S7在含16 ug/mL慶大霉素的普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，而在含32 ug/mL四環(huán)素的普通瓊脂培養(yǎng)基上完全不生長(zhǎng);D2在含32ug/mL四環(huán)素的普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，而在含16 ug/mL慶大霉素的普通瓊脂培養(yǎng)基上完全不生長(zhǎng);并且S7、D2在同時(shí)

4、含16 ug/mL慶大霉素和32 ug/mL四環(huán)素的普通瓊脂培養(yǎng)基上均完全不生長(zhǎng)。
　　采用溶菌酶（Lysozyme，又稱胞壁質(zhì)酶）法制備S7、D2原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體制備過(guò)程中添加EDTA至終濃度為0.01 mol/L。通過(guò)溶菌酶濃度試驗(yàn)，最終選擇3.0ug/mL的溶菌酶濃度作為制備S7原生質(zhì)體的最佳溶菌酶濃度，在此濃度下S7能夠得到62.88％的原生質(zhì)體制備率及33.55％的原生質(zhì)體再生率;而制備D2原生質(zhì)體的最佳溶菌酶濃度為

5、2.5 ug/mL，能夠得到51.69％的原生質(zhì)體制備率及27.79％的原生質(zhì)體再生率。
　　進(jìn)行原生質(zhì)體融合并根據(jù)條件篩選后最終得到7株能夠穩(wěn)定遺傳的融合菌株。融合菌株呈革蘭氏陰性桿菌，均能凝集鴨源沙門氏菌和鴨源大腸桿菌陽(yáng)性血清;硫化氫生化試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，其余生化試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果為陰性。
　　根據(jù)外膜蛋白基因保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)雙重PCR檢測(cè)融合菌株部分基因片段，其中3株能夠同時(shí)檢測(cè)到鴨源沙門氏菌的目的條帶，3株僅能