豬源益生菌的篩選及抗沙門氏菌感染的研究.pdf

1、自發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素在多種常見細菌感染性疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。然而因抗生素濫用導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生、食品的抗生素殘留、住院病人腸道菌群紊亂、水源和土壤的抗生素污染等一系列問題，如今抗生素的負面作用已引起全球的廣泛關(guān)注。尋找綠色安全、高效無毒的抗生素替代品迫在眉睫。大量研究表明，益生菌在促進動物生長、增強機體免疫力、抗細菌感染、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用，是一種理想的抗生素替代品。
　　本研究擬從偏遠山區(qū)農(nóng)戶未飼用

2、混合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬糞便中，篩選對低pH值和高膽鹽有較好耐受性，且同時產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的芽孢桿菌菌株；篩選耐酸和膽鹽且能同時抑制Eerichia coli O157:H7、Sphylococcus typhimurium和Slmonella sonnei三種常見腸道致病菌的乳酸桿菌菌株。通過添加到雛雞日糧中，研究其對雞生長和免疫性能的影響，為高效飼用益生菌制劑產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
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3、挑選重慶山區(qū)從未添食配合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬，采集其新鮮糞便，樣品經(jīng)80℃水浴15 min后在LB培養(yǎng)基上分離細菌，分離株再經(jīng)pH3.02 h、0.5％膽鹽24 h處理，挑選存活率均高于90%的菌株。用透明圈法檢測其產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的能力，利用API生化反應(yīng)及16S rDNA片段核苷酸序列進行細菌鑒定。結(jié)果顯示，共分離到7株菌能同時產(chǎn)生這三種酶，分別命名為P1.1-4、P1.1-10、P1.2-1、P1.2-3、P1.

4、3-1、P1.3-5、P1.4-2。其中，P1.1-4產(chǎn)淀粉酶能力最強，D/d值為2.03，P1.1-10、P1.3-1具有高產(chǎn)蛋白酶能力，D/d值分別為7.90和6.56，7株菌產(chǎn)纖維素酶能力差異不大，D/d值均在1.5左右。經(jīng)生化鑒定與16S rDNA分子鑒定這7株菌為嗜熱脂肪芽孢桿菌（P1.2-1），地衣芽孢桿菌（P1.3-5）和枯草芽孢桿菌（P1.1-4、P1.1-10、P1.2-3、P1.3-1、P1.4-2）。
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5、.從上述新鮮糞便中分離到6株耐酸、耐膽鹽的乳酸桿菌，經(jīng)生化鑒定與16S rDNA分子鑒定為德氏乳酸桿菌（P3-a），植物乳酸桿菌（P3-b），嗜酸乳酸桿菌（P1.1-a、P1.1-c、P4-a、P5-a）。測定各菌株對10種常用抗生素的敏感性，結(jié)果表明，所有菌株對環(huán)丙沙星和慶大霉素耐藥，對氯霉素敏感，對克林霉素、甲硝唑、芐星青霉素、萬古霉素有不同程度的敏感性；P3-b、P5-a對磺胺沒有明確的耐藥、敏感折點，其余4株乳酸桿菌對磺胺耐藥；

6、P1.1-a、P1.1-c對5種抗生素耐藥。平板試驗表明這6株乳酸桿菌的培養(yǎng)液對E.coli O157:H7、S.typhimurium和S.sonnei均有抑制作用，其中，植物乳酸桿菌P3-b對三種致病菌的抑制作用最強，抑菌圈分別為16.2 mm、15.3 mm和17.8 mm。在MRS中培養(yǎng)24 h后，P1.1-c、P3-a的pH值下降至4.2左右， P1.1-a、P3-b、P4-a、P5-a下降至3.5。將三種致病菌分別接種于用乳

7、酸桿菌P3-b培養(yǎng)液調(diào)制的MRS液體培養(yǎng)基中，其生長曲線均表現(xiàn)為pH值越低生長越緩慢。小鼠試驗表明，植物乳酸桿菌P3-b能減輕小鼠感染Citrobacter rodentium所致的體重下降。
　　3.選用產(chǎn)淀粉酶較強的P1.1-4、產(chǎn)蛋白酶較強P1.3-1和抑菌效果最好的乳酸桿菌P3-b來研究豬源益生菌對雛雞抗沙門氏菌感染的作用。將108 CFU/mL的芽孢桿菌和/或108 CFU/mL的乳酸桿菌拌料飼喂20日齡的海蘭灰雞，一周

8、后感染沙門氏菌（1×1010 CFU/只），并持續(xù)添食益生菌三周。感染后每天檢測糞便中的沙門氏菌的數(shù)量；每周稱空腹體重并記錄采食量，計算料重比；將雞處死后后取肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、胰腺、脾臟及法氏囊進行組織學(xué)分析。結(jié)果顯示，感染后1天，各組糞便中檢測到的沙門氏菌含量差異不大，沙門菌106 CFU/g左右，之后各組致病菌含量隨感染時間的延長呈下降趨勢。其中安慰組和芽孢桿菌組下降最快，且在感染6天后糞便中檢測不到沙門菌；感

9、染對照組下降最慢，在感染12天后糞便中檢測不到沙門菌。芽孢桿菌組的平均日增重為7.36 g，料重比為9.6，顯著優(yōu)于感染對照組（P＜0.05），乳酸桿菌組和混合菌液組略好于感染對照組。添食益生菌后雞小腸的肌層厚度無明顯變化，單一或復(fù)合添食乳酸桿菌和芽孢桿菌能提高雞大腸段的肌層厚度。單一添食乳酸桿菌對腸道絨毛長度無顯著影響，添食芽孢桿菌或混合菌能明顯增加腸道的絨毛長度。添食芽孢桿菌的雞脾臟和法氏囊明顯增大，免疫器官指數(shù)顯著高于感染對照組（

10、P＜0.05)，組織學(xué)觀察顯示法氏囊內(nèi)淋巴細胞大量增生，僅添食乳酸桿菌的雞法氏囊未見明顯變化。雞腸道主要病變?yōu)槟c粘膜分葉核白細胞浸潤和毛細血管擴張充血或出血。添食芽孢桿菌組和添食混合菌組的腸道粘膜毛細血管的擴張充血和出血較感染對照組輕微，其中混合菌組與感染對照組有顯著性差異（P＜0.05）；腸道分葉核白細胞浸潤程度沒有顯著性差異。
　　綜上所述，本研究從健康豬糞便中篩選出7株產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的芽孢桿菌和6株乳酸桿菌。對雛