豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的擴散及膨潤土促其耐藥基因轉(zhuǎn)移機制的研究.pdf

1、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）是一類能夠水解青霉素，第一代、第二代、第三代頭孢菌素及氨曲南等抗生素的一種酶，能夠被酶抑制劑所抑制，但對頭霉素、碳青霉烯類抗生素敏感。攜帶這種酶的細菌可以水解相應的抗生素從而導致治療失敗。近年來，產(chǎn)ESBL微生物在世界范圍內(nèi)不斷出現(xiàn)，廣泛分布于醫(yī)院臨床、社區(qū)環(huán)境以及畜牧環(huán)境中。該酶主要存在于大腸桿菌以及克雷伯氏菌，給公共健康帶來了極大的威

2、脅。包括三種主要的類型TEM，SHV以及CTX-M，通常位于可移動遺傳片段上。另外，菌株的克隆性傳播是ESBL基因擴散的另一重要途徑。近年來，養(yǎng)殖環(huán)境中由于抗生素的大量使用甚至濫用，越來越多的ESBLs在養(yǎng)殖環(huán)境中出現(xiàn)。這些動物源性的產(chǎn)ESBL的大腸桿菌會通過各種途徑向環(huán)境中擴散，甚至通過動物產(chǎn)品進入食物鏈，給公共衛(wèi)生帶來了潛在的威脅。
　　目前CTX-M是不同環(huán)境中主要的流行類型。主要發(fā)現(xiàn)于質(zhì)粒上，在不同的細菌之間，基因能夠水平

3、轉(zhuǎn)移進行傳遞，從而進行耐藥的擴散。接合轉(zhuǎn)移使其進行散播的主要方式，通常受到環(huán)境等其他因素的影響。
　　膨潤土是以蒙脫石為主要成分的粘土類物質(zhì)，我國產(chǎn)量豐富，主要成分為SiO2和Al2O3。膨潤土由于具有吸附性好、粘附性、含礦物質(zhì)等特性，廣泛用于畜禽及水產(chǎn)動物飼料添加劑用以吸附動物消化道內(nèi)的有毒物質(zhì)，延長飼料通過動物消化道的速度，防止畜禽類非細菌性腹瀉。然而，膨潤土是否會對耐藥基因的轉(zhuǎn)移造成影響，引起了人們的廣泛關(guān)注。為了解目前我國

4、的養(yǎng)豬環(huán)境中產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及其對周圍環(huán)境的影響，以及飼料添加劑對ESBL基因在細菌之間接合轉(zhuǎn)移的影響極其機制，我們展開了以下的研究。
　　1.養(yǎng)豬環(huán)境中豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及分子特點的研究
　　為了解產(chǎn)ESBL大腸桿菌在山東地區(qū)的流行情況及其對環(huán)境的影響，我們從山東地區(qū)的10個豬場中采集豬場糞便樣品，豬場內(nèi)外的空氣樣品，水和淤泥樣品以及土壤樣品，分離產(chǎn)ESBL的大腸桿菌，并對其特點進行分析。我們從六

5、個豬場中共分離的到119株產(chǎn)ESBL的大腸桿菌他們分別來自不同的糞便樣品和環(huán)境樣品，另外四個豬場中沒有得到產(chǎn)ESBL的大腸桿菌。同一場中來源于糞便和環(huán)境樣品的產(chǎn)ESBL大腸桿菌在耐藥表型方面顯示極高的相關(guān)性，ESBL基因以CTX-M和TEM為主，同一場中不同來源的分離株CTX-M亞型種類相同，而不同場之間的分離株卻不具備這種相似性。這表明，產(chǎn)ESBL大腸桿菌在該地區(qū)流行較為嚴重，且會對周圍環(huán)境造成影響。
　　2.養(yǎng)殖場中糞便的利用

6、引起的產(chǎn)ESBL大腸桿菌對土壤的污染情況研究
　　以產(chǎn)ESBL大腸桿菌為指示菌，分別從糞便、堆肥及土壤中采集樣品以進一步研究產(chǎn)ESBL大腸桿菌對土壤環(huán)境的影響。共分離得到42株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，其中有29株來自于糞便樣品;分離率為72.5％，3株來自于堆肥，分離率為15％;10株來自于場外農(nóng)田中采集的土壤樣品，分離率為12.5％。來自于豬場的樣品及來自于土壤的樣品都顯示了多重耐藥，攜帶CTX-M和TEM，主要為CTX-M-14和

7、CTX-M-15亞型，復制子類型以F為主，多種復制子并存，且ERIC-PCR結(jié)果顯示三株土壤分離株與糞分離株的同源性高于90％，這表明他們可能來自于同一株大腸桿菌。以上結(jié)果說明了土壤中的產(chǎn)ESBL大腸桿菌很可能來源于糞便。
　　3.飼料添加劑膨潤土對耐藥基因CTX-M-15水平傳播的促進作用研究
　　CTX-M-15是主要的流行亞型，因此我們以攜帶CTX-M-15的F16為供體菌，它能夠?qū)︻^孢噻肟產(chǎn)生耐藥性但對卡那霉素敏感，

8、攜帶卡那抗性的BL21(DE3)為受體菌建立了體外轉(zhuǎn)移模型，研究飼料添加劑膨潤土對這種耐藥基因轉(zhuǎn)移的促進作用。結(jié)果顯示該基因可在不同的大腸桿菌之間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，而飼料添加劑膨潤土能夠提高攜帶CTX-M-15的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率高達4-20倍。且接合效率受溫度及膨潤土濃度的影響。當膨潤土的濃度為100μg/mL時，這種促進作用最明顯。
　　4.膨潤土刺激下CTX-M-15耐藥基因水平傳播的差異蛋白質(zhì)組研究
　　為研究飼料添加劑膨潤

9、土對CTX-M-15基因的促轉(zhuǎn)移機制，我們采用比較蛋白質(zhì)組學研究膨潤土是否存在條件下，接合菌的蛋白質(zhì)組學變化。將膨潤土培養(yǎng)條件下的混合菌提取蛋白進行雙向電泳，尋找差異表達蛋白。將雙向電泳中的2倍以上，p值小于0.05的差異點用于質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示有48個蛋白進行了差異表達，有29個發(fā)生差異表達的蛋白得以成功鑒定。生物信息學分析顯示這些蛋白包括25種酶及4個蛋白質(zhì)，參與多種生物學過程，包括糖酵解、壓力應激、轉(zhuǎn)運、蛋白合成、其他物質(zhì)的合成、

10、碳水化合物的代謝、乳糖代謝、抗生素抗性、甘油代謝、生物膜的形成及細胞趨性。在這些鑒定得到的蛋白中，主要是參與各種生物學過程的酶。這4個主要蛋白，分別為外膜通道蛋白、ABC周質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、MipA互作蛋白及ABC運輸ATP結(jié)合蛋白。
　　5.膨潤土刺激下CTX-M-15水平傳播蛋白的轉(zhuǎn)錄水平及其作用研究
　　根據(jù)Genebank上這這四個蛋白的序列，分別設(shè)計了四個基因tolC，malE，mipA及ybiT的實時熒光定量引物及全基