上海某豬場(chǎng)大腸桿菌中mcr-1基因的傳播機(jī)制研究.pdf

1、近年來由于多耐藥革蘭陰性菌的廣泛流行，尤其是碳青霉烯耐藥革蘭陰性菌株的不斷出現(xiàn)，使得黏菌素這一老藥被重新用于治療這些多重耐藥菌，不幸地是，黏菌素耐藥現(xiàn)象也變得越來越嚴(yán)重。多粘菌素的耐藥往往是由染色體突變?cè)斐傻?，而最近出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1，自報(bào)道之后，mcr-1基因成為研究熱點(diǎn)。本研究對(duì)首次發(fā)現(xiàn)mcr-1基因的上海某豬場(chǎng)大腸桿菌進(jìn)行mcr-1基因檢測(cè)，以進(jìn)一步研究該豬場(chǎng)的mcr-1流行情況和傳播機(jī)制，為控制mcr-1基

2、因的擴(kuò)散提供理論依據(jù)。
　　對(duì)2013年7月份分離自上海市某豬場(chǎng)的47株大腸桿菌采用PCR方法檢測(cè)mcr-1基因，結(jié)果有27株（57.4％）多粘菌素不敏感且全部檢測(cè)到mcr-1基因，說明了該豬場(chǎng)大腸桿菌對(duì)黏菌素耐藥機(jī)制主要由mcr-1介導(dǎo)。
　　采用瓊脂稀釋法測(cè)定mcr-1陽性大腸桿菌對(duì)抗菌藥的敏感性，結(jié)果表明27株mcr-1陽性菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為77.8%（21/27），對(duì)頭孢噻肟的耐藥率為33.3%（9/27），對(duì)磷

3、霉素的耐藥率為25.9%（7/27），對(duì)氯霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明的耐藥率均達(dá)到100%，表明所有菌株都呈現(xiàn)不同程度的多重耐藥現(xiàn)象。所有陽性菌株對(duì)阿米卡星和亞胺培南均敏感。
　　通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）方法研究mcr-1陽性大腸桿菌間的克隆傳播關(guān)系。PFGE分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)26株分型成功，1株分型失敗，26株分型成功的可以分為A-S這19個(gè)型，表明大部分mcr-1陽性大腸桿菌不存在克隆傳播關(guān)系。
　　對(duì)27株mcr-1陽

4、性大腸桿菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)以研究質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性，結(jié)果有22株成功接合，其中有2株各獲得2株不同接合子，5株多次接合均失敗。對(duì)獲得的24株接合子進(jìn)行復(fù)制子分型，分別有9、6、4、2株為IncX4、IncHI2、IncI2、IncF型質(zhì)粒，其他3株分別為IncY、IncHI2和IncY、F:2 A-B:53和IncX4型，表明攜帶mcr-1的質(zhì)粒豐富多樣。采用PCR方法檢測(cè)接合子中其他耐藥基因的攜帶情況，發(fā)現(xiàn)5株IncHI2型質(zhì)粒同時(shí)檢測(cè)到

5、blaCTX?M?14、fosA3、oqxAB和floR，1株IncHI2型質(zhì)粒檢測(cè)到blaCTX?M?14、fosA3和floR，還有1株IncHI2型質(zhì)粒檢出blaCTX?M?15、fosA3、oqxAB和floR，說明IncHI2型質(zhì)粒往往攜帶blaCTX?M、fosA3、oqxAB和floR耐藥基因與mcr-1共同傳播。
　　采用PCR-mapping方法對(duì)mcr-1基因上下游側(cè)翼序列進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)了3種不同類型的基因環(huán)

6、境，其中有7株在mcr-1基因的上游檢測(cè)到了插入序列ISApl1，有6株在mcr-1的上下游均檢測(cè)到了ISApl1，其他14株在mcr-1的上下游均未測(cè)到ISApl1。
　　對(duì)24株攜帶mcr-1基因的大腸桿菌接合子和5株陽性原菌進(jìn)行S1-PFGE并與mcr-1探針進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果顯示，IncX4型質(zhì)粒大小約為28.8～33.3kb，IncI2型質(zhì)粒大小約為54.7～78.2kb，IncY型質(zhì)粒大小約為78.2kb，

7、IncHI2型質(zhì)粒大小約為216.9～-244.4kb，F(xiàn)29型質(zhì)粒大小約為54.7kb，F(xiàn)53型質(zhì)粒大小約為138.9kb，未接合成功的5株原菌中有1株的mcr-1基因位于染色體上，其他均位于質(zhì)粒上，其中1株質(zhì)粒大小約為28.8～33.3kb，1株質(zhì)粒大小約為244.4～310.1kb，其他2株質(zhì)粒大小約為78.2～104.5kb。
　　本研究結(jié)果表明，mcr-1基因在該豬場(chǎng)廣泛傳播，主要通過IncHI2、IncX4和IncI2