解脲脲原體與淋球菌耐藥表型及基因型的流行病學研究.pdf

1、目的：(1)調查江蘇省局部地區(qū)解脲脲原體的耐藥狀況并提出用藥建議；(2)研究江蘇省局部地區(qū)解脲脲原體的耐藥機制(包括對四環(huán)素類、氟喹諾酮類和大環(huán)內酯類藥物)；(3)根據(jù)解脲脲原體兩個不同基因型的基因組差別建立和評價新的基因分型方法，并進行初步的臨床應用；(4)研究江蘇省淋球菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制。研究方法：(1)用法國梅里埃支原體鑒定試劑盒進行解脲脲原體(Uu)與人型支原體(Mh)的初步分離和鑒定，并對解脲脲原體培養(yǎng)陽性物進一步經

2、過濾培養(yǎng)和特異性PCR試驗進行確認。(2)應用微量肉湯稀釋法檢測八種抗生素(四環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、克拉霉素、阿齊霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星)對確認的84株解脲脲原體的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。(3)按藥敏結果分層，從84株解脲脲原體菌株中隨機抽取34株，用PCR擴增四環(huán)素耐藥基因tetM；隨機抽取28株，采用PCR擴增氟喹諾酮耐藥基因gyrA的氟喹諾酮耐藥決

3、定區(qū)(QRDR)，并對擴增產物進行測序分析，采用Blast比對法比較臨床菌株序列與標準菌株序列的差異。(4)基于解脲脲原體14個血清型的23S rRNA基因序列的差異，采用primei premier5.0軟件設計PCR引物和選取限制性內切酶，自行建立解脲脲原體的基因分型方法，通過與標準菌株和“金標準”鑒定的臨床菌株比較，對其進行評價并初步應用于臨床菌株進行基因分型和分析。(5)根據(jù)淋球菌藥敏結果，從已經鑒定為淋球菌的95株菌株中，分層

4、隨機抽取54株，采用PCR擴增氟喹諾酮耐藥基因g3mA和parC的QRDR，并進行DNA測序，分析其突變位點與藥敏結果MIC的相關關系。(6)結合實驗結果和流行病學調查資料，采用卡方檢驗、方差分析、秩和檢驗和精確概率法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 研究結果：(1)解脲脲原體對米諾環(huán)素、四環(huán)素、克拉霉素、阿齊霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星的MIC<,50>(50﹪的菌株被抑制的濃度)分別為<0.0625、<0.125、0.

5、25、1、2、8、4和2mg/L；MIC<,90>(90﹪的菌株被抑制的濃度)分別為0.125、1、1、4、8、64、16和8mg/L。(2)大環(huán)內酯類抗生素(克拉霉素、阿齊霉素和紅霉素)的耐藥水平(包括MIC幾何均數(shù)和耐藥率)在有Mh合并感染組與無Mh合并感染組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，伴隨Mh感染的解脲脲原體對大環(huán)內酯類抗生素的MIC水平和耐藥率都較高。(3)在34株非四環(huán)素耐藥的解脲脲原體菌株中，有7株檢測到tetM基因。t

6、etM基因陽性組的四環(huán)素和米諾環(huán)素的MIC水平都比tetM陰性組高，且有統(tǒng)計學意義(四環(huán)素：t=-4.34，P=0.0001：米諾環(huán)素：t=-5.90，P<0.0001)。在28株解脲脲原體菌株中，經測序分析發(fā)現(xiàn)gyrA基因出現(xiàn)三種突變形式：①302位堿基C→T的突變，導致101位(相當于大腸桿菌84位)丙氨酸改變?yōu)槔i氨酸：②336位堿基C→A的突變，導致112位(相當于大腸桿菌95位)天冬氨酸改變?yōu)楣劝彼幔孩?67位堿基T的缺失。發(fā)生

7、gyrA基因突變的主要是耐藥菌株和中度敏感菌株，在敏感菌株沒有發(fā)現(xiàn).gyrA基因突變；所有有基因改變的菌株其氟喹諾酮類藥物的MIC水平明顯高于沒有突變的菌株組。(4)在標準菌株中，PCR-RFLP(PCR為基礎的限制性酶切多態(tài)性分析)方法分型能力為100﹪，同時分型結果有較好的特異性和可重復性，電泳圖譜清晰易于分辨和解釋。在通過“金標準”鑒定的臨床菌株中，該分型方法的靈敏度為97﹪，特異度為89﹪，重復試驗一致率為98﹪。PCR陽性擴增

8、模板兩次獨立分型實驗的一致率為90.62﹪；PCR-RFLP分型結果與測序分型結果的一致率為100﹪。(5)有生殖道感染病史和合并Mh感染的解脲脲原體基因型主要表現(xiàn)為生物1型，而合并霉菌感染的解脲脲原體主要為混合型。不同型別的解脲脲原體對四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氟喹諾酮類藥物的敏感性存在統(tǒng)計學差異，其MIC的平均水平均表現(xiàn)為T960型高于生物1型。解脲脲原體基因型與氟喹諾酮類藥物耐藥相關的.gyrA基因的氨基酸改變有較強的相關性，出現(xiàn)氨基

9、酸Asp95Glu改變的菌株均屬于T960型，而無此改變的菌株均不屬于T960型。(6)分離的95株淋球菌對環(huán)丙沙星100﹪的耐藥；通過測序分析，在54株淋球菌中檢測到gyrA和parC的18種突變形式。環(huán)丙沙星的MIC水平在不同parC基因突變組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)，parC基因突變位點越少其MIC相對較低，突變位點越多其MIC相對較高。研究結論：(1)在江蘇局部地區(qū)第三代以前的氟喹諾酮類藥物和紅霉素MIC水平較高，

10、耐藥嚴重，此類藥物不宜作為治療解脲脲原體感染的一線藥物，而四環(huán)素類藥物可以重新作為治療解脲脲原體感染的一線藥物，尤其是米諾環(huán)素抗菌效果最好，其次為克拉霉素和阿齊霉素。(2)在非耐四環(huán)素類的解脲脲原體菌株中也存在tetM基因的攜帶，但比例不高：解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥主要是由于gyrA基因突變導致相應氨基酸改變所介導。(3)PCR-RFLP基因分型試驗在標準菌株和臨床菌株中均有較高的靈敏度、特異度和可重復性，PCR擴增產物測序分型

11、結果與酶切分型結果一致率較好，酶切圖譜清晰，結果易解釋，試驗操作簡單，儀器設備要求不高，適合大樣本的流行病學調查分型所用。(4)不同基因型別的解脲脲原體對四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氟喹諾酮類藥物的敏感性存在差異，T960型的MIC平均水平高于生物1型。解脲脲原體基因型與氟喹諾酮類藥物耐藥相關的gyrA基因所表達的氨基酸改變有高度的相關性，在所選菌株中T960型均出現(xiàn)gyrA編碼氨基酸Asp95Glu的改變。(5)江蘇淋球菌對環(huán)丙沙星藥物耐藥