奶牛乳腺炎葡萄球菌種類、毒力基因及抗性基因與耐藥性的調(diào)查分析.pdf

1、乳腺炎是制約世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要疾病之一。奶牛乳腺炎的病原微生物種類繁多，但以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，其中金黃色葡萄球菌是接觸傳染性病原菌，而且具有公共衛(wèi)生意義;凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci，CNS)有20多種，已成為許多國(guó)家奶牛乳腺炎的主要病原菌，但不同國(guó)家流行的CNS種類不同。葡萄球菌毒力基因多達(dá)數(shù)十種，但具體的致病作用知之甚少。奶牛乳腺炎主要靠加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和使用

2、抗菌藥物進(jìn)行控制，但隨著抗生素的長(zhǎng)期、盲目使用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)對(duì)奶牛乳腺炎葡萄球菌的系統(tǒng)研究較少，本研究對(duì)乳腺炎葡萄球菌的種類、毒力基因、抗性基因及其與耐藥表型的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查分析，旨在為奶牛乳腺炎葡萄球菌致病與耐藥機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　一、奶牛乳腺炎葡萄球菌的分離與種類鑒定
　　根據(jù)臨床檢查和乳汁體細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，在2012年6月到2014年6月期間采集乳腺炎陽(yáng)性奶樣209份，接種血瓊脂平板培養(yǎng)后挑

3、取疑似菌落，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，篩選到104份葡萄球菌感染陽(yáng)性奶樣。在分離的104株葡萄球菌中，所有菌株均為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，29株(27.9％)為耐熱核酸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，27株(26.0％)為凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，24株(23.1％)為耐熱核酸酶基因檢測(cè)陽(yáng)性，28株(26.9％)為凝固酶基因檢測(cè)陽(yáng)性。綜合上述結(jié)果，將28株(26.9％)初步鑒定為金黃色葡萄球菌，76株(73.1％)鑒定為CNS。用PCR擴(kuò)增葡萄球菌蛋白翻譯Tu延

4、伸因子(elongation Tu factor， Tuf)和16SrRNA基因片段并進(jìn)行序列測(cè)定，以同源性≥98％為種的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，將28株確認(rèn)為金黃色葡萄球菌，76株CNS分為13個(gè)種，其中阿爾萊特葡萄球菌(S.arlettae)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)和產(chǎn)色葡萄球菌(S.chromogenes)為優(yōu)勢(shì)CNS，分別占15.8％;表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、模仿葡萄球菌(S.

5、simulans)、馬胃葡萄球菌(S.equorum)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)和沃氏葡萄球菌(S.warneri)次之，豬葡萄球菌(S.hyicus)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)和蒼蠅葡萄球菌(S.muscae)為次要CNS，各占1.3％。這些研究結(jié)果表明，葡萄球菌是該場(chǎng)奶牛乳腺炎的主要病原菌，并以CNS為主，但優(yōu)勢(shì)CNS種類不同于國(guó)外報(bào)道;Tuf基因序列

6、分析可用于葡萄球菌種的鑒定，但少數(shù)菌株需用16S rRNA基因序列予以確認(rèn)。
　　二、奶牛乳腺炎葡萄球菌毒力基因的檢測(cè)與分析
　　將37個(gè)葡萄球菌毒力基因分為普通毒力基因、外毒素基因和生物被膜形成基因。以葡萄球菌基因組DNA為模板進(jìn)行單一、雙重或多重PCR檢測(cè)，結(jié)果在28株金黃色葡萄球菌中，14個(gè)普通毒力基因的檢出率依次為凝固酶基因coa和免疫球蛋白結(jié)合蛋白基因Ig(100％)、溶血素A基因hla(96.4％)、溶血素B基因

7、hlb和纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因fib(92.9％)、凝集因子A基因clfA(89.3％)、凝集因子B基因clfB和耐熱核酸酶基因nuc(85.7％)、MHCⅡ類分子類似物蛋白基因map(78.6％)、莢膜多糖5基因cap5(46.4％)、莢膜多糖8基因cap8和彈性蛋白結(jié)合蛋白基因ebp(39.3％)以及膠原結(jié)合蛋白基因cna(10.7％);12個(gè)外毒素基因的檢出率依次為腸毒素G基因seg(14.3％)、腸毒素Ⅰ基因sei(10.7％)

8、和腸毒素A基因sea(7.1％);11個(gè)生物被膜形成基因的檢出率依次為層粘連蛋白結(jié)合蛋白基因eno(100％)、葡萄球菌蛋白A基因spa(96.4％)、纖連蛋白結(jié)合蛋白B基因fnbB(75.0％)、細(xì)胞粘附D基因icaD(71.4％)、附屬調(diào)節(jié)1基因agr-1(64.3％)和附屬調(diào)節(jié)2基因agr-2(17.9％)。這些毒力基因以19個(gè)不同的基因組合存在，但僅1個(gè)為優(yōu)勢(shì)毒力基因組合(32.1％)。在76株CNS中，普通毒力基因的檢出率依次

9、為Ig(18.4％)、map(11.8％)和cap8(1.3％)，外毒素基因的檢出率依次為sei(5.3％)和seb(2.6％)，生物被膜形成基因的檢出率依次為eno(53.9％)、bap(10.5％)、agr-2(3.9％)、fnbA(2.6％)和fnbB(2.6％)，其毒力基因組合不僅數(shù)量少，而且非常簡(jiǎn)單。多數(shù)金黃色葡萄球菌均攜帶溶血素A基因，提示對(duì)奶牛乳腺的致病性較強(qiáng)。所有葡萄球菌的外毒素和生物被膜基因檢出率均顯著低于國(guó)外報(bào)道，提

10、示其相關(guān)致病機(jī)制的復(fù)雜性。
　　三、奶牛乳腺炎葡萄球菌抗性基因檢測(cè)及其與耐藥性的關(guān)系分析
　　以葡萄球菌基因組DNA為模板，用單一、雙重或多重PCR檢測(cè)甲氧西林抗性基因mecA，氨基糖苷類抗性基因aacA-aphD、aac(6')/aph(2'')、aph(3')-Ⅲa和ant(4')-Ⅰa，鏈陽(yáng)霉素A抗性基因vatA、vatB和vatC，紅霉素與克林霉素抗性基因ermA、ermB和ermC，四環(huán)素抗性基因tetK和tetM

11、，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因msrA和msrB，林可酰胺類抗性基因linA，以及青霉素抗性基因blaZ。結(jié)果在28株金黃色葡萄球菌中，17種抗性基因的檢出率依次為blaZ(82.1％)、mecA(35.7％)、aacA-aphD(32.1％)、aac(6')/aph(2'')(28.6％)、tetK(10.7％)、ermC(7.1％)和linA(7.1％)，多數(shù)菌株攜帶多個(gè)抗性基因組合且含blaZ基因。在76株CNS中，抗性基因的檢出率依次為l

12、inA(38.2％)、tetK(34.2％)、blaZ(30.3％)、aacA-aphD(21.1％)、msrB(19.7％)、mecA和msrA(17.1％)、ermC(13.2％)、aac(6')/aph(2'')(10.5％)、ermB(9.2％)和tetM(2.6％)，mecA基因主要見于松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌，多數(shù)菌株攜帶多個(gè)抗性基因組合，其中表皮葡萄球菌的抗性基因組合最多。藥敏試驗(yàn)分析結(jié)果顯示在28株金黃色

13、葡萄球菌中，100％對(duì)兩種或以上抗生素耐藥;82.1％對(duì)青霉素耐藥，與blaZ基因密切相關(guān);46.4％對(duì)鏈霉素耐藥，與aacA-aphD、aac(6')/aph(2'')或未知基因相關(guān);35.7％對(duì)卡那霉素和妥布霉素耐藥，32.1％對(duì)慶大霉素耐藥，與aacA-aphD或aac(6')/aph(2'')基因相關(guān);32.1％對(duì)頭孢西丁耐藥，主要與blaZ和mecA基因相關(guān);14.3％對(duì)紅霉素耐藥，與ermC或未知基因相關(guān);10.7％對(duì)四環(huán)素

14、耐藥，與tetK或未知基因相關(guān)。在76株CNS中，79.4％對(duì)兩種或以上抗生素耐藥;86.8％對(duì)青霉素耐藥，與blaZ或未知基因相關(guān);48.7％對(duì)紅霉素耐藥，與erm、msr或未知基因相關(guān);46.1％對(duì)鏈霉素耐藥，27.6％對(duì)卡那霉素耐藥，13.2％對(duì)慶大霉素耐藥，11.8％對(duì)妥布霉素耐藥，與aacA-aphD、aac(6')/aph(2'')或未知基因相關(guān);39.5％對(duì)四環(huán)素耐藥，與tet基因密切相關(guān);30.3％對(duì)克林霉素耐藥，與er