奶牛乳腺炎來源的葡萄球菌甲氧西林抗性傳播的機(jī)制研究.pdf

1、葡萄球菌是導(dǎo)致人畜共患病的主要病原菌之一，在畜禽上可引起急性或慢性傳染病，給畜禽帶來嚴(yán)重的健康威脅，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來抗生素的過度使用催生了耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)，這類葡萄球菌外源性獲得了一種染色體盒式結(jié)構(gòu)（SCCmec）。位于SCCmec上的mecA(或者mecC)基因編碼的PBP2a蛋白參與細(xì)胞壁的合成，對內(nèi)酰胺類抗生素有很低的親和力，從而介導(dǎo)MRS對內(nèi)酰胺類藥物的抗性。臨床上，MRS的檢測通常是通過抗性表

2、型篩選的方法來實(shí)現(xiàn)的。
　　大量間接證據(jù)表明MRS菌株之所以大量出現(xiàn)并廣泛傳播，是因?yàn)镾CCmec可以在不同菌種和不同菌株之間進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移。水平基因轉(zhuǎn)移是抗性傳播的主要方式，SCCmec從基因組上切除是SCCmec轉(zhuǎn)移到其他菌株的起始步驟，也是最為關(guān)鍵的一步。SCCmec的切除是由自身攜帶的編碼盒式染色體重組酶基因ccr介導(dǎo)的。目前為止，常用抗生素如何調(diào)控SCCmec切除和轉(zhuǎn)移的信號通路并不清楚，亟待研究。
　　近年來，

3、一種新型的MRS菌株，即表型敏感，mecA陽性的耐甲氧西林葡萄球菌(OS-MRS)不斷被報(bào)道。這類葡萄球菌含有SCCmec/mecA，卻沒有抗性表型，會被錯(cuò)誤的診斷為甲氧西林敏感葡萄球菌。而OS-MRS菌株在內(nèi)酰胺類抗生素的刺激下，可以在短時(shí)間內(nèi)由敏感表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦呖贡硇?，苯唑西林最低抑菌濃度高達(dá)128μg/mL以上。這會導(dǎo)致治療失敗，病情加重等情況，對人類和畜禽健康，甚至生命造成巨大威脅。因此，找到參與OS-MRS菌株表型調(diào)控和表型轉(zhuǎn)變

4、的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子就成了解決這類問題的首要任務(wù)，值得深入研究。
　　實(shí)驗(yàn)一通過抗生素標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，對采集來的244個(gè)牛生鮮乳樣品中是否殘留抗生素進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，超過50％的樣品含有抗生素。隨機(jī)選擇了39個(gè)含有抗生素的樣品，進(jìn)一步檢測了其中5種特定抗生素（環(huán)丙沙星、氯霉素、磺胺嘧啶、鏈霉素和四環(huán)素）的具體殘留量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選取的39個(gè)含抗生素樣品中，環(huán)丙沙星的殘留量均超過歐盟制定的最大殘留限制標(biāo)準(zhǔn)(MRLs);此外，2種、3種

5、、4種和5種抗生素在單樣品中同時(shí)超出標(biāo)準(zhǔn)(MRLs)的樣品數(shù)量分別是11個(gè)、9個(gè)、13個(gè)和2個(gè)。
　　試驗(yàn)二通過多種分子生物學(xué)手段，試圖確定畜牧中廣泛使用的一些抗生素是通過何種信號通路，最終促進(jìn)重組酶ccr基因的表達(dá)和SCCmec的轉(zhuǎn)移起始。從試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，很多抗生素能顯著促進(jìn)重組酶ccr基因的表達(dá)和SCCmec的切除，包括內(nèi)酰胺類，糖肽類，四環(huán)素類，磺胺類，喹諾酮類等抗生素。在這些抗生素中，靶向DNA的抗生素能在濃度很低的情況

6、下誘導(dǎo)ccr的表達(dá)。因此，推測，抗生素可能通過激活SOS修復(fù)途徑，進(jìn)而上調(diào)ccr的表達(dá)。經(jīng)過體內(nèi)的敲除實(shí)驗(yàn)和體外的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)，抗生素在一定劑量下能夠引起葡萄球菌的DNA損傷，DNA的損傷激活SOS信號通路，信號通路中的重要蛋白LexA從ccr基因的啟動子上脫落下來，Ccr的表達(dá)促進(jìn)SCCmec的切除。
　　試驗(yàn)三研究了耐甲氧西林葡萄球菌中甲氧西林抗性表型的調(diào)控機(jī)制。使用牛奶源分離得到的葡萄球菌菌株作為實(shí)驗(yàn)材料，通過基因

7、表達(dá)水平差異比較，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性因子BlaR1和BlaI的表達(dá)量是影響抗性表型和抗性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素。在OS-MRS菌株中，BlaR1和BlaI都是高表達(dá)，在無抗生素誘導(dǎo)的情況下，高表達(dá)的BlaI能抑制mecA的表達(dá)，從而降低抗性表型;而在抗生素誘導(dǎo)的情況下，高表達(dá)的BlaR1可以通過活化解除BlaI的抑制作用，促進(jìn)PBP2a在短時(shí)間內(nèi)高表達(dá)，以恢復(fù)抗性表型應(yīng)對抗生素的刺激。
　　綜上所述，實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果建議，牛生鮮乳中抗生素殘留的常規(guī)檢

8、測對于避免畜牧生產(chǎn)中抗生素的不合理使用是必要的。試驗(yàn)二的結(jié)果詳細(xì)闡明了多種抗菌制劑促進(jìn)葡萄球菌甲氧西林抗性傳播的機(jī)制，意義重大。在畜禽養(yǎng)殖上，甚至在人類疾病的臨床治療上，這對如何設(shè)計(jì)治療方案和所用抗生素劑量以應(yīng)對MRS感染產(chǎn)生直接影響。同時(shí)，為抗菌制劑的研發(fā)提供了新的方向，即如何以一種有效的但不會促進(jìn)抗生素耐藥性擴(kuò)散的思維方式去進(jìn)行新藥研發(fā)。實(shí)驗(yàn)三的結(jié)果提示，在對MRS，包括OS-MRS進(jìn)行篩選鑒定的過程中，要把bla基因簇的影響考慮進(jìn)