魚類細(xì)菌性爛鰓病病原研究及其營養(yǎng)相關(guān)基因和毒力基因缺失載體的構(gòu)建.pdf

1、細(xì)菌性爛鰓病是危害淡水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要細(xì)菌性疾病之一,癥狀為爛鰓、鰭條或皮膚潰爛,可危害多種魚類并造成大量死亡,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要研制一種應(yīng)用方便、綠色、安全的疫苗來防治魚類細(xì)菌性爛鰓病,而國內(nèi)尚無爛鰓病減毒活疫苗方面的研究。本研究對分離的爛鰓病病原進(jìn)行了分類鑒定,克隆了asd、aroA和clsA基因并分別構(gòu)建了基因缺失自殺性質(zhì)粒載體,從而為構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型或主要毒力因子缺失型突變株提供了平臺(tái),為探索開發(fā)具有產(chǎn)業(yè)化

2、前景的浸泡型魚類細(xì)菌性爛鰓病基因減毒活疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。主要工作如下:
　　 本研究從發(fā)病的斑點(diǎn)叉尾鲴、斑鳠、鰻鱺和草魚上分離到病原,經(jīng)回歸感染試驗(yàn)證明是爛鰓病的病原菌。四株菌電鏡結(jié)果表明,菌株GHS061212和Mg2形態(tài)一致,無莢膜結(jié)構(gòu),而菌株M168和M165有明顯的莢膜結(jié)構(gòu)。常規(guī)生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示四株菌均為黃桿菌屬；為進(jìn)一步確定到種,對各菌株的16S rRNA基因部分序列進(jìn)行了測定和分析,結(jié)果表明菌株M165和M1

3、68與約氏黃桿菌Flavobacterium johnsoniae strain H2P6(EU221404)的同源性最高,為99.9％；菌株GHS061212和Mg2與柱狀黃桿菌.Flavobacterium columnare(AY841899)的同源性最高,分別為98.2％和99.8％,以16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,菌株M165和M168與約氏黃桿菌聚類,菌株GHS061212和Mg2與柱狀黃桿菌聚類。根據(jù)以上結(jié)果將

4、菌株M165和M168鑒定為約氏黃桿菌,菌株GHS061212和Mg2為柱狀黃桿菌,研究結(jié)果表明魚類細(xì)菌性爛鰓病的病原有柱狀黃桿菌和約氏黃桿菌兩種,并在國內(nèi)首次報(bào)道了約氏黃桿菌為魚類爛鰓病的病原。
　　 營養(yǎng)缺陷型菌株的構(gòu)建主要是通過缺失細(xì)菌代謝所必須的酶的基因,致使細(xì)菌在環(huán)境中及宿主體內(nèi)不能增殖而使其毒力減弱。asd基因所編碼的天冬氨酸半醛脫氫酶是二氨基庚二酸(DAP)合成途徑中的關(guān)鍵酶,aroA基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-

5、3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)是芳香族氨基酸合成中的關(guān)鍵酶。本研究分別克隆了asd和aroA基因,并分別構(gòu)建其自殺性質(zhì)粒載體。根據(jù)asd(Aspaltate-semialdehyde dehydrogenase)基因和aroA(aromatic amino acid biosynthesis)基因的保守序列設(shè)計(jì)引物,以菌株M165基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到兩基因的核心序列,再利用基因組步移方法擴(kuò)增得到asd和aroA基因的全長及兩翼

6、序列。其中所測的asd基因及其兩翼序列全長2097bp,asd基因開放閱讀框(ORF)位于531bp～1521bp,長990bp,5’非編碼區(qū)為為530bp,3’非編碼區(qū)為.576bp。成功構(gòu)建自殺性質(zhì)粒載體pRE112△asd,該質(zhì)粒缺失asd基因ORF內(nèi)部783bp的核苷酸序列,且缺失了asd基因的催化活性位點(diǎn)Cys127和His235。所測的aroA基因及其兩翼序列全長1579bp,aroA基因開放閱讀框(ORF)位于306bp～

7、1536bp,長1230bp,編碼410aa,該基因5’非編碼區(qū)為306bp,3’非編碼區(qū)為43bp。成功獲得反向選擇標(biāo)記自殺性質(zhì)粒載體pRE112△amA,其缺失aroA基因內(nèi)部773bp的核苷酸序列,使aroA基因移碼突變。為構(gòu)建約氏黃桿菌asd和aroA基因缺失突變株提供了基礎(chǔ)。
　　 硫酸軟骨素AC裂解酶能夠降解酸性多糖,被認(rèn)為是柱狀黃桿菌的毒力因子。clsA基因編碼硫酸軟骨素AC裂解酶,因此,本研究根據(jù)GenBank中

8、登陸的clsA基因序列擴(kuò)增得到clsA基因的全序列,并通過引物改造獲得clsA基因的長度為663bp的N端上游同源臂和567bp的C端下游同源臂,經(jīng)過重疊PCR得到長為1230bp的同源臂突變盒,再與自殺性質(zhì)粒pRE112定向連接,成功得到重組自殺性質(zhì)粒載體pRE112△clsA,缺失片段長為1082bp,其中包含了clsA的四個(gè)催化位點(diǎn),為野生型的柱狀黃桿菌毒力基因突變株的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。
　　 本研究在國內(nèi)首次研究報(bào)道約氏黃