甜瓜細菌性果斑病菌Ha17A致病相關基因的克隆.pdf

1、甜瓜細菌性果斑病病原菌為燕麥食酸菌話瓜亞種[Acidovorax avenae subsp.citrulli]，該病害對許多國家和地區(qū)西瓜和厚皮甜瓜的生產(chǎn)造成了嚴重危害。目前，對甜瓜細菌性果斑病的研究多側(cè)重于檢測和鑒定，然而對其病原物致病性分子機制的研究卻鮮有報道。本研究對燕麥食酸菌西瓜亞種Ha17A菌株的致病相關基因進行了初步的研究。 首先，針對燕麥食酸菌西瓜亞種的致病性特點，建立了一套便捷的篩選燕麥食酸菌西瓜亞種突變菌株篩選

2、體系——離體葉片篩選法。根據(jù)已發(fā)表的A.avenae subsp.citrulli AAC00-1基因組序列設計引物hrcV26303和hrcV27493擴增type Ⅲ分泌系統(tǒng)保守基因hrcV的部分序列，構建自殺載體pSR47s-hrcV，定位突變Ha17A菌株的hrcV基因，獲得致病性完全喪失的突變菌株17A-hrcV。用離體葉片篩選法對17A-hrcV突變菌株進行致病性測定，結果顯示hrcV基因的突變菌株完全喪失了致病性，證明ty

3、peⅢ系統(tǒng)在Ha17A的致病性中具有重要作用，同時也確認了篩選體系的合理性。 其次，利用三親雜交的方法將帶有抗卡那霉素標記的Tn5轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入甜瓜果斑病菌Ha17A的細胞中，Tn5隨機插入到Ha17A基因組DNA上，獲得大量的突變菌株；利用離體葉片篩選法，從600個突變菌株中篩選到3個致病性明顯減弱的突變菌株D33、B17和F8。 另外，通過“鳥槍法”克隆到兩個突變菌株D33和B17的Tn5側(cè)翼序列；序列比對結果顯示D33

4、和B17中被突變的基因均為功能未知的基因，本研究分別命名為hd33基因和hb17基因。根據(jù)突變菌株D33的鳥槍法克隆的測序結果設計引物，擴增目標基因的一段序列，構建自殺載體17A-pSR47s，對野生型菌株Ha17A進行定位突變，得到了致病力完全喪失的突變菌株17A-hd33，證明hd33基因與菌株Ha17A的致病性密切相關。 本研究所建立的離體葉片篩選法，為燕麥食酸菌西瓜亞種致病性減弱突變菌株的篩選工作提供了一個相對便捷的實驗