瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌及辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、植物病原細(xì)菌可導(dǎo)致多種嚴(yán)重的植物病害，引起多種農(nóng)作物、花卉及林木等植物產(chǎn)量、質(zhì)量等嚴(yán)重受損甚至絕產(chǎn)，因此，任何快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)植物病原細(xì)菌的方法對(duì)防止該病害的發(fā)生、流行等環(huán)節(jié)都是有意義的。
　　 瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌（AcidovoraXavenae subsp.Citrulli，Aac）是西瓜、甜瓜及哈密瓜等瓜類(lèi)作物上重要的植物病原細(xì)菌，可導(dǎo)致西瓜等作物嚴(yán)重減產(chǎn)甚至整株死亡，在美國(guó)被稱(chēng)為西瓜的“癌癥”，是典型的種傳病害，被列為我

2、國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物之一。
　　 目前，該病害已在我國(guó)境內(nèi)部分地區(qū)發(fā)生，且危害嚴(yán)重，探索快速、有效的檢測(cè)瓜類(lèi)果斑病菌的方法迫在眉睫。
　　 番茄及辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病（Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria，Xcv）是番茄及辣椒上重要的病原菌之一，是典型的種傳病害，危害十分嚴(yán)重。該病菌廣泛分布于亞、非、歐、美等部分國(guó)家和地區(qū)，被歐洲及地中海植物保護(hù)組織列為A2 類(lèi)檢疫性有害生物，建立特

3、異、靈敏的檢測(cè)技術(shù)對(duì)保證我國(guó)辣椒進(jìn)出口貿(mào)易安全意義重大。
　　 本研究中，利用GICA-PCR 技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)分別對(duì)瓜類(lèi)細(xì)菌性果斑病菌和辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌進(jìn)行了檢測(cè)研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 （1）膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方便、快捷，整個(gè)反應(yīng)僅需幾分鐘時(shí)間，應(yīng)用十分廣泛，但試紙條若使用不當(dāng)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，僅適用于對(duì)病原菌的初篩。本研究將膠體金免疫層析方法（GICA）與PCR 技術(shù)結(jié)合，建立了GICA

4、-PCR 檢測(cè)Aac 病菌的方法。檢測(cè)結(jié)果表明，該方法在蛋白質(zhì)與核酸兩個(gè)方面，提高了瓜類(lèi)果斑病菌試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，有效解決了試紙條檢測(cè)的假陽(yáng)性問(wèn)題，并可以從發(fā)病的西瓜葉片上檢測(cè)到果斑病菌。因此，所建立的GICA-PCR 方法值得在口岸局檢測(cè)中推廣和應(yīng)用。
　　 （2）實(shí)時(shí)熒光PCR 較普通PCR 方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，節(jié)省了反應(yīng)結(jié)束后的電泳的步驟，避免了溴化乙錠或其他核酸染料的污染，并可實(shí)時(shí)觀(guān)察擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物量變化。

5、本研究針對(duì)辣椒寄主的Xcv 病菌rhs 家族基因的序列片段，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物及探針XCV-F-F/R/P，特異性檢測(cè)辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌。所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)體系擴(kuò)增Xcv基因片段的長(zhǎng)度為71 bp，最低可檢測(cè)菌液的濃度為9×103 cfu/ml，檢測(cè)DNA的極限濃度為2.8×104 copies/ml，二者靈敏度相似，且均比普通PCR的靈敏度高約10倍。
　　 經(jīng)實(shí)驗(yàn)可證明，該熒光PCR 體系可以達(dá)到特異性檢測(cè)受侵染的辣椒